環境DNA技術在魚類生態學中的應用研究進展

李 苗,陳小勇

1 中國科學院大學,北京 100049 2 中國科學院昆明動物研究所遺傳資源與進化國家重點實驗室 &云南省高黎貢山生物多樣性與生態安全重點實驗室,昆明 650201 3 中國科學院東南亞生物多樣性研究中心,緬甸內比都 05282 4 云南省東南亞生物多樣性保護國際聯合實驗室,勐臘 666303

在全球變化的大背景之下,生物多樣性銳減是21世紀人類面臨的重要挑戰之一[1]。水生生態系統作為一種重要的生態系統,其不僅能夠為人類提供大量食物、工農業以及生活用水,而且其還具有商業、航運交通以及休閑娛樂等其他諸多功能,是人類社會快速發展必不可少的條件[2—3]。然而,由于過度捕撈、生物入侵、水環境污染以及生態位的不斷喪失和改變,全球的水生生物多樣性一直在持續下降[4]。魚類作為水生生態系統中的重要組成部分之一,其對于物質循環、能量流動以及生態系統的自我調節與穩定至關重要[5]。然而,在長期高強度的人為干擾下,全球魚類的很大一部分正在迅速地走向滅絕[6]。據《地球生命力報告2020》的結果顯示全球的地球生命力指數、物種生境指數以及生物多樣性完整指數均在持續下降[7],其中處于生物可持續水平的魚類種群占比已由1974年的90%下降至2017年的65.8%[8]。為了能夠有效的保護魚類多樣性,對水生生態系統進行長期持續的監測至關重要。然而,由于傳統的魚類資源調查方法存在一定的局限性而無法滿足上述要求,因而尋求一種行之有效的魚類監測方法迫在眉睫。

近年來,科研人員逐漸意識到環境DNA(eDNA)技術可作為傳統生物監測方法的輔助手段之一,在未來甚至能夠完全取代傳統方法成為一種常規化的水生生物監測方法。eDNA是指從水體、沉積物、土壤以及空氣等環境樣本中獲取到的沒有預先被分離的所有生物的總DNA[9—13]。對于魚類等大型生物而言,從環境中捕獲到的DNA主要來源于生物體與環境之間的相互作用,并通過皮膚細胞、毛發或鱗片的脫落以及代謝廢物排泄的方式將遺傳物質釋放到環境中[12,14]。科研人員可對eDNA進行采集,并將其作為物種監測的證據[15]。相較于傳統的魚類監測方法而言,eDNA技術具有靈敏度高、經濟高效、省時省力、采樣受限小以及對生態系統無干擾等諸多優點[16],因而倍受廣大生態學研究領域科研人員的青睞。目前,eDNA技術已經被廣泛的應用于國內外魚類生態學的研究領域之中,且表現出極大的潛力[17—20]。然而,隨著eDNA技術在魚類生態學研究應用中的不斷深入,也暴露出其所存在的一些問題與缺陷,例如:(1)eDNA技術在實際應用中操作流程的不規范導致不同研究之間的結果無法進行對比[21];(2)基因參考數據庫的缺乏導致大量生境中實際存在的物種無法被進行有效的注釋[22];(3)eDNA被釋放后的生態學過程尚未明確,致使研究結果中產生假陽性與假陰性錯誤[23]。上述問題的存在不僅揭露了eDNA技術目前在魚類生態學研究領域內的不足之處,同時也在一定程度指明了eDNA技術未來發展的方向以及科研工作者應該關注的焦點。

本文將系統的對eDNA技術的發展歷程、分析流程、在魚類生態學研究領域中的研究進展以及eDNA技術目前所面臨的問題與挑戰進行闡述,并對eDNA技術未來的發展方向與應用前景做出了展望。通過本文,以期能夠對國內eDNA技術在魚類生態學研究中的規范使用具有指導意義,同時能夠推動eDNA技術在國內的快速發展。

1 eDNA技術簡介

eDNA這一詞匯最早于1987年被提出,其最初被應用于沉積物中環境微生物學的研究[24],而其真正得到研究人員的認可并被正式應用于生態學研究領域卻是在2000年之后[25]。自Ficetola等首次應用eDNA技術對入侵物種美國牛蛙Ranacatesbeiana進行監測之后[26],eDNA技術開始在水生生態系統這一研究領域得到了廣泛應用,其研究對象幾乎囊括了所有水生生物類群,包括魚類[27—29]、兩棲類[30—31]、哺乳類[32—33]、甲殼類[34—35]、水生昆蟲[36—37]、微生物[38—39]以及浮游動植物[40—42]等。同時,隨著測序技術與聚合本酶鏈式反應(PCR)技術的發展,eDNA技術的應用由最初的單物種監測[26]發展到對整個生物群落的監測[43],也由定性監測[26](目標種有無的監測)發展到了定量監測(生物量評估與豐度監測)[44]。總而言之,eDNA技術在水生生態系統中的應用為水生生物資源的生態調查開辟了一條新的道路。

2 eDNA技術的分析流程

eDNA技術的操作流程主要包括eDNA樣品采集、eDNA提取、PCR擴增、測序以及結果分析等主要步驟,具體如圖1所示:

圖1 eDNA技術的操作流程Fig.1 Operation procedure of eDNA technology eDNA:環境DNA Environmental DNA;PCR:聚合酶鏈式反應 Polymerase Chain Reaction;NGS:二代測序 Next Generation Sequencing

2.1 eDNA樣品采集

在魚類生態學研究領域中eDNA樣品的采集方式分為主動采集與被動采集兩種,其中主動采集方式包括水樣采集與沉積物樣品采集,而被動采集則是在自然水域中尋找那些能夠富集eDNA的生物作為天然的eDNA采樣器。

2.1.1水樣采集與eDNA富集

據現有的研究表明,eDNA水樣的采集量一般集中在15 ml—10 L,以1 L與2 L最為常見[45],而在具體研究中水樣的采集量通常會根據實驗的需求有所差異。與組織DNA相比,水環境中的DNA屬于微量,甚至是痕量,所以在水樣采集之后首先要對水體中的DNA進行富集以提高物種的檢出率。關于eDNA的富集方式,當前主要的方法有酒精沉淀法和過濾法[46],前者主要用于小體積水樣的DNA富集,對于人造生態系統的水樣采集較為適合,而后者則主要用于大體積水樣的DNA富集,適合用來對河流與海洋等水域開闊的自然生態系統進行DNA富集。酒精沉淀法主要是用3 mol/L的醋酸鈉溶液以及無水乙醇與水樣混合來進行DNA富集[47],而過濾法則是利用過濾裝置對水樣進行過濾將DNA截留在濾膜上以達到富集的效果[46],在過濾過程中濾膜的合理選用至關重要。然而,由于不同研究人員具有不同的研究目的與研究對象,在利用過濾法進行DNA富集時所選取的濾膜也不盡相同。就目前現有的研究可知,在進行eDNA富集時研究人員最為常用的濾膜為玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、聚碳酸酯膜、混合纖維膜以及尼龍膜,而最為常見的濾膜孔徑則為0.45 μm與1.2 μm兩種[48]。為了能夠使研究結果更加精確,作者建議在具體的研究中研究人員應該針對自己的研究對象對水樣的采集量以及eDNA富集方法進行篩選,以達到最佳的效果。

2.1.2沉積物樣品采集

eDNA沉積物樣品的采集方案應該根據水深、底質類型以及目標生物類群而定[49]。對于以魚類為目標類群的研究而言,表層沉積物樣品的采樣量一般集中在0.25—10 g[50],采樣設備的選用則根據生態系統的類型有所不同,其中對于大型河流和深度為幾百米以內淺海的沉積物樣品一般選用抓斗進行采樣[51—52],而對于湖泊和深海等底質較為松軟的沉積物樣品則利用巖芯進行采樣[53—54]。此外,由于沉積物中DNA的混合不均勻,通常還需要在采樣點所在的區域內進行子樣本的采集[55]。

2.1.3eDNA的被動采集

由于eDNA的主動采集方式往往需要科研人員在野外花費大量的時間采集樣品,為了能夠節省野外調查的時間,相關研究人員開始嘗試從自然界中尋找天然的eDNA富集器或者設計富集能力很強的特殊材料來完成eDNA的被動采樣,諸如在海洋生態系統中以海綿作為純天然的海水過濾器,通過采集海綿來進行魚類生態調查[56—58],更有甚者是利用3D打印的羥基磷灰石作為DNA富集器將其置于采樣點處來完成eDNA的被動采樣[59]。然而,上述被動采樣的方式雖然在一定程度上節省了時間與經濟成本,但關于其在具體科學問題的解決方面是否合理有效還有待進一步的證實。

2.2 eDNA的提取

鑒于eDNA樣品成分復雜且含有較多的雜質,為了能夠提高后續實驗中目標物種的檢出率,如何從樣品中提取出高質量的DNA至關重要。在eDNA技術應用到水生生態系統研究領域的初期,傳統的酚-氯仿-異戊醇法以及各種商業化的試劑盒均被應用于eDNA的提取,但提取效果參差不齊,而后有研究人員專門對常用的幾種商業化試劑盒與酚-氯仿-異戊醇法提取水環境中eDNA的效果做了對比,發現使用商業化的試劑盒能夠提取更高質量的eDNA[46]。目前最新的研究中基本上采用商業化的試劑盒來進行eDNA的提取,其中提取水樣eDNA使用較多的試劑盒為DNeasy Blood &Tissue Kit(QIAGEN)與Mo Bio Power Water DNA Extraction Kit兩種[46,60],而提取沉積物樣品eDNA使用較多的試劑盒主要為DNeasy PowerSoil DNA Isolation Kit (QIAGEN)與DNeasy PowerMax Soil Kit (QIAGEN)兩種[49,50]。

2.3 引物設計與PCR擴增

PCR引物的設計和DNA條形碼區段的選擇在eDNA技術的應用中也是至關重要的一環,這對后續實驗結果的精確性具有決定性的作用。根據實驗目的的不同,通常可以分為目標物種的特異性監測和某特定生物類群的多樣性監測。特異性監測主要是針對某一特定的物種設計特異性極強的引物從而能夠在PCR過程中只擴增該物種的基因序列而不會擴增其他親緣物種的基因序列,多樣性監測則是針對某特定的生物類群設計通用性引物,要求能夠盡可能多的覆蓋該生物類群的基因序列。目前常用的引物設計軟件主要有Primer Premier、Oligo、Beacon Designer、PrimerHunter以及Primer Express等[61—62],引物設計在線網站主要有NCBI Primer-Blast、Primer3 Plus、Bath Primer、The PCR Suit、Primerbank 以及PrimerX等。

目前研究人員選取的條形碼區段主要集中在線粒體上,主要原因在于與細胞核DNA(nDNA)相比,線粒體DNA(mtDNA)具有以下三個優點[63]:(1)美國國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫中含有大量的mtDNA基因序列數據,有利于進行eDNA的序列比對;(2)細胞中mtDNA的拷貝數要遠高于nDNA的拷貝數;(3)mtDNA相對保守,含有更多的能夠進行物種鑒定的高變區以及易于設計通用引物的保守區。關于mtDNA目的基因的選擇最常見的主要有(表1)細胞色素c氧化酶亞基I (COI) 基因[80—81]、細胞色素b (Cytb) 基因[82—83]、12s核糖體RNA(12s rRNA)基因[22,84]以及16s核糖體RNA(16s rRNA)基因[85—86]等,而具體在研究中該選擇哪個基因作為目標基因則取決于研究所選取生物類群的特征。同時,引物的選擇對eDNA監測的結果也具有一定的影響,例如Zhang等通過Silico PCR的方法比較了22對硬骨魚類的通用引物并將其用于北京市的河流水樣中進行PCR擴增,發現12s rRNA區段的引物能夠監測到的魚類多樣性要優于其他基因區段的引物[87]。此外,Shu等類似的研究也證實了上述觀點[88]。因此,在選擇PCR擴增所用的引物時要遵循以下3個原則:(1)由于eDNA降解嚴重,因而引物擴增的片段不宜過長,要保證能夠盡可能多的回收樣品中的DNA[89—90];(2)所選擇的引物要保證具有良好的擴增效果,既要能準確地擴增目標類群,同時又不會發生非特異性擴增[91—92];(3)所選擇引物擴增的目標區域最好能夠具有完善的基因參考數據庫,能夠使盡可能多的測序數據被注釋到種的水平[93]。

表1 環境DNA技術在魚類監測中常用的通用引物Table 1 Universal primers commonly used in environmental DNA technology for fish monitoring

2.4 測序與數據分析

在應用eDNA技術進行單物種監測時,PCR產物用傳統的一代測序即可,而在用宏條形碼進行物種多樣性監測時,往往用高通量測序(NGS)更為合適,主要原因在于高通量測序速度快、數據量大且準確性高。目前,eDNA研究領域中應用的高通量測序主要為擴增子測序,應用較多的測序平臺主要為Illumina Miseq、Illumina Hiseq、Illumina NextSeq以及Roche GS FLX 454等[47,94—96]。

測序之后就是對數據進行分析,一代測序的數據在NCBI上進行比對即可確定目標種的有無,高通量測序的原始下機數據處理則較為復雜,其主要流程包括質量控制、過濾、分子可操作分類單元(MOTU)聚類以及對代表性MOTU序列進行BLAST比對和物種注釋(圖2)。目前測序數據處理的主流軟件主要有Mothur[97]、OBITools[87]、Usearch[98]、Vsearch[99]、PhyloPythia[100]、Cutadapt[95]、QIIME[101]以及QIIME 2[102]等。通常來說,對高通量測序數據的分析要求科研人員具有一定的編程基礎,但為了方便那些無編程背景的科研人員,生物公司通常開發了高通量測序數據處理的生物信息云計算平臺,例如MiFish Pipeline (http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/)魚類多樣性在線數據分析平臺等[103]。

圖2 測序數據的分析流程Fig.2 Analysis process of sequencing dataMOTU:分子可操作分類單元Molecular Operational Taxonomic Units

3 eDNA技術在魚類生態學研究領域中的應用

自eDNA技術被引入水生生態系統的研究領域以來,在魚類生態學研究中得到了廣泛的應用。目前,eDNA技術主要被用來進行魚類的目標物種監測、生物量評估、多樣性監測與評價、繁殖活動監測、種群遺傳分析以及攝食生態等方面的研究[23,104]。在本部分,將以eDNA技術在魚類生態學研究中應用最為廣泛的4個方向展開論述。

3.1 目標物種監測

精確地掌握目標物種的空間分布與豐度情況對研究物種的生態習性與制定相關的保護政策至關重要[105]。對于魚類等水生生物而言,其所生存的環境在一定程度上增加了物種監測的困難性[48],尤其是針對那些種群密度極小物種的調查,諸如隱存種、瀕危種、稀有種以及處于入侵早期的入侵種。同時,由于傳統方法往往很難捕獲到密度極小的種群,從而無法精確地掌握其種群動態。鑒于上述原因,科研人員嘗試利用eDNA技術進行極小密度種群的監測。目前,eDNA技術在極小密度種群監測應用中的成功案例主要有入侵魚類與珍惜瀕危魚類的監測兩個方面。

生物入侵是生物多樣性喪失和全球同質化的主要原因之一[106—107]。一旦入侵成功,入侵種會對當地的農業、林業、漁業、電力生產以及貿易產生嚴重的影響,進而造成當地經濟的大量損失[108]。為了能夠有效地遏制生物入侵,最佳的解決辦法便是在入侵種尚未形成較大種群時就將其消除[107]。Nakao等利用eDNA技術對5個大壩庫區的大口黑鱸Micropterussalmoides、小口黑鱸Micropterusdolomieu以及藍鰓太陽魚Lepomismacrochirus這3種入侵魚類進行了監測,結果表明eDNA技術可以被作為一種生物入侵監測的工具,但同時也發現了一些問題,例如該技術在一些eDNA濃度較低的采樣點靈敏度較低[19]。因此,未來在用eDNA技術進行入侵種的監測時,尚有許多難題需要攻克。

珍稀瀕危魚類通常因其極小的種群密度而難以用傳統的調查方法對其種群動態進行監測[107],而掌握其種群的分布與豐度狀況對于保護策略的制定至關重要[109]。許多珍稀瀕危物種自種群數量急劇下降之后便很難用傳統的方法對其進行監測,這為科研人員的工作帶來了極大的困難,eDNA技術的出現則使上述情況出現了轉機。Cardás等利用eDNA技術對西班牙北部納隆河和薩拉河的歐洲鰻鱺Anguillaanguilla進行了監測[110],證實了eDNA在瀕危魚類監測方面的潛力。此外,Budd等利用eDNA技術對美國關島西太平洋海域的路氏雙髻鯊Sphyrnalewini進行了監測,并建立了相關的監測體系,其中特別值得關注的是基于傳統方法的調查自1970年開始便再未捕獲到路氏雙髻鯊[111]。由此可見,eDNA技術是一種強有力的珍稀瀕危魚類監測工具。

3.2 生物量評估

生物量是生態學研究領域中重要的基礎生物學參數之一[112],準確地評估生物量對于種群大小的管理[113—114]、自然資源的保護[115]、生態系統的功能與服務[116]以及生態交互作用[117]具有十分重要的意義。自上個世紀以來,有關動物種群生物量評估方法的研究一直是科研人員與政策制定者所關注的焦點[118]。然而,對于魚類等水生生物類群而言,準確的評估其生物量是十分困難的[112]。同時,現有的評估方法通常成本高昂、耗時耗力且對于種群數量極小的物種無法開展有效的工作[119—120]。為了解決上述問題帶來的困擾,Takahara等首次提出利用eDNA技術來評估魚類的生物量,并將該技術應用到了鯉Cyprinuscarpio的生物量評估中,其原理主要是尋找魚類釋放到水環境中的eDNA的濃度與魚類生物量之間的關系,進而建立相應的生物量評估模型[112]。自此之后,利用eDNA技術探究魚類生物量的研究日益增多。為了摸清魚類的生長對eDNA技術進行生物量評估的影響,Mizumoto等以日本北部的瀕危物種遠東哲羅鮭Parahuchoperryi為研究對象,探究了由不同生長階段的遠東哲羅魚組成的魚群釋放eDNA的濃度與其生物量之間的關系,結果表明在魚類生物量恒定的情況下,不同規格的魚所組成的魚群釋放的DNA的濃度是相等的[121]。然而,以往在自然水域中進行的研究,結果通常顯示eDNA的濃度與生物量之間的相關性并不是很強[119]。為了能夠進一步提高利用eDNA技術進行生物量評估結果的精確性, Fukaya等提出在利用eDNA評估魚類生物量時應充分考慮eDNA時空分布形成的機制,并以日本竹筴魚Trachurusjaponicus為研究對象證實了只有在某些特定的假設條件下才能夠利用廣義線性模型來準確地評估魚類的種群數量[122]。但時至今日,關于eDNA在水環境中動態變化的情況尚無定論,而這始終是阻礙利用eDNA技術評估魚類生物量的一大障礙。因此,在未來一段時間內,如何利用eDNA技術精確地評估魚類的生物量仍是該領域內的熱點與難點問題之一。

3.3 生物多樣性監測與評價

生物多樣性是衡量物種豐富程度的重要指標之一,而生物多樣性調查則是開展生物多樣性評價的重要基礎性工作,如何獲取精確的調查數據將會對后續的研究工作產生重要的影響。傳統的魚類多樣性調查方法主要依賴于魚類標本的采集,諸如底拖網、圍網、流刺網、地籠以及電捕魚法等,但上述方法往往具有一定的選擇性,不能夠全面系統地對研究區域內的魚類多樣性做出精確的評價。隨著分子生物學技術的不斷發展,Thomsen等開創性地應用eDNA技術對丹麥海域的魚類多樣性進行了調查,結果發現了15種魚類,其中包括一罕見種——歐洲沙丁魚Sardinapilchardus。同時,為了驗證eDNA技術在魚類多樣性監測方面的效率,Thomsen等還將eDNA調查的結果與9種傳統調查方法的結果進行了對比,表明利用eDNA監測到的魚類物種數高于或者等于傳統方法,證實了eDNA在魚類多樣性調查方面具有極大的潛力[47]。此后,利用eDNA進行魚類多樣性調查的相關研究日益增多[65—66]。

在利用eDNA技術進行魚類多樣性研究的初期,研究人員最為關注的是eDNA技術在魚類監測方面的能力,相關研究的主題主要是利用eDNA技術與傳統方法同時對某特定研究區域內的魚類多樣性進行調查,進而驗證eDNA技術是否可被用來進行魚類多樣性的調查[47]。在經過大量研究的證實之后,eDNA技術逐漸開始被用來解決具體的科學問題,例如魚類群落時空分布的動態變化[123—124]、魚類群落中各物種相對豐度的情況[66,125]、魚類群落的系統發育多樣性[126]以及功能多樣性[127—128]等。然而,生物多樣性監測的目的是為了進行生物多樣性評價。為了得到準確的評價結果,如何選擇合適的評價指標與標準尤為重要[129—130]。盡管基于eDNA技術的監測方法能夠提供比傳統方法更多的可用于生物多樣性評價的信息[131],但目前尚未有一套基于eDNA技術的生物多樣性評價體系。未來要想將基于eDNA技術的方法整合到現有的生物多樣性監測與評價體系中,還需要從國家與國際的層面來采取行動以制定相關的標準[131]。

3.4 魚類繁殖活動監測

精確地掌握魚類產卵的時間與場所有助于人類更加清楚地認識魚類的繁殖習性、準確地評估魚類種群的繁殖力,進而能夠針對當前的資源狀況制定相關的開發利用與保護策略。然而,當前在魚類早期資源調查中所用到的調查方法通常會導致受精卵與仔稚魚死亡率的升高,進而會對受威脅種與稀有種的種群繁殖造成極大的傷害。鑒于上述原因的考慮,相關科研人員嘗試利用eDNA技術來探究魚類產卵的時間與場所。Bylemans等利用eDNA技術對澳洲麥氏鱸Macquariaaustralasica的產卵時間與場所進行了調查,研究發現在繁殖期水體中nDNA的量要顯著高于mtDNA的量,而在其他時期nDNA的量與mtDNA的量大致相等。因此,可以根據棲息環境中魚類nDNA與mtDNA相對豐度的變化來識別產卵時間與場所[69]。Bracken等以海七鰓鰻Petromyzonmarinus為研究對象,利用qPCR對愛爾蘭境內2條河流中固定點位eDNA的時空分布進行了連續3年的監測,研究結果發現在海七鰓鰻的繁殖期,河流中eDNA的濃度將會顯著升高,表明eDNA技術可以被用來進行魚類繁殖活動的監測[132]。此外,還有大量類似的研究同樣支持利用eDNA技術進行魚類繁殖活動的監測[133—135]。

盡管目前已有大量研究利用eDNA技術對魚類繁殖活動進行了監測,并證明eDNA技術在該方面具有一定的潛力,但其在實際應用中仍存在些許問題。就當前利用eDNA技術進行魚類繁殖活動監測的研究而言,所選取的研究對象多為人類已熟知其生活習性并掌握了其繁殖時間的物種,從而能夠使科研人員根據已掌握的情況結合eDNA量的變化來推斷魚類的產卵活動,而對那些生活習性沒有被人類所掌握的魚類來說,則無法使用該方法來進行判斷。因此,未來應著重探究在尚未熟知魚類生態習性的背景下如何利用eDNA技術精確地識別魚類的繁殖時間與繁殖場所。

4 eDNA技術在魚類生態學研究領域中面臨的挑戰

應用eDNA技術進行魚類調查的主要目的是為了能夠精確的掌握某特定研究區域內魚類資源的狀況[79],從而解決一些具體的科學問題。因此,為了能夠保證eDNA研究結果的精確性,闡明影響eDNA研究結果精確性的因素至關重要[136]。目前,eDNA技術在魚類生態學研究領域的具體應用中產生的錯誤主要有假陽性與假陰性兩種類型,而造成上述錯誤的主要原因來自于eDNA釋放到環境中之后的一系列生態學過程以及eDNA分析流程中的各個方面。鑒于此,為了能夠使科研人員在應用eDNA技術的過程中盡量避免假陽性與假陰性錯誤的產生,本部分將針對造成eDNA研究結果中各類錯誤的原因展開詳細的論述并提出可能的解決方案。

4.1 eDNA技術操作流程的標準化

隨著eDNA技術在魚類生態學研究領域內的日益流行,尋求一套能夠使研究結果最佳的eDNA技術操作流程與實驗方案已成為科研人員關注的熱點問題之一[137—138]。當前已有研究表明,水樣采集量、eDNA的富集與提取方法、PCR擴增目的基因的選擇等均會對研究結果的精確性產生影響[27,46,139]。同時,也有大量研究對eDNA技術的操作流程進行了優化,但現有的研究更多的是針對某些特定的生物類群以及研究區域所做出的優化,在一定程度上不具有普適性,從而也就使不同區域的研究結果無法進行相應的對比[21,48]。為了能夠在更大尺度上使利用eDNA技術調查獲得的數據具有可比較性,同時能夠使政策制定者在相應政策的制定上不做出誤判,eDNA技術的應用必須規范化、標準化[21]。目前,歐洲標準化委員會(CEN)已經在討論制定歐盟成員國在使用eDNA技術進行生物監測時的標準化問題[140],日本也成立了專門的eDNA學會并編寫了一本eDNA技術標準化的研究手冊[21]—“Environmental DNA Sampling and Experiment Manual” (http://ednasociety.org/en/manual)。然而,目前國內關于eDNA領域的研究日益增多,但不同單位的科研人員在采樣以及實驗方案的設計等方面存在諸多差異,這將使不同研究之間結果的精確性無法被進行準確地評估。因此,為了能夠使eDNA技術在國內廣泛的正確使用,政府部門應該盡快出臺相應的研究手冊,以確保在全國范圍內使用eDNA技術獲取的生物監測數據能夠具有良好的對比性。

針對上述eDNA技術分析流程標準化的問題,相關部門在編寫eDNA研究手冊時應著重考慮樣品采集、DNA富集與提取、PCR擴增以及后續的生物信息學分析等方面標準的制定。目前,已有不少研究專門針對eDNA技術的分析流程進行了優化,相關研究結果可作為eDNA技術標準化的參考依據[46,55,141—142]。通過對現有文獻的整理即可發現在魚類生態研究領域中eDNA樣品的采集應以水樣采集為主,水樣采集地點要盡可能覆蓋各種生境類型,水樣的采集量則以1 L或2 L為最佳且每個采樣點至少采集3個平行樣本[94,143]。關于eDNA的富集方法一般推薦使用過濾的方法將DNA截留在濾膜上,而濾膜材質與孔徑的選擇則主要傾向于0.45 μm的玻璃纖維濾膜[141]。富集之后則需要對eDNA進行提取,就eDNA的提取而言當前主要推薦使用商業化的試劑盒,其中提取效果較好的試劑盒主要為Qiagen′s DNeasy Blood &Tissue Kit與Mo Bio Power Water DNA Extraction Kit兩種[46,60]。eDNA提取之后PCR擴增測序過程中需要標準化的主要是引物的選取,當前在關于引物的選用方面較為推薦使用12s rRNA基因的通用引物[87,88]。測序之后需要標準化的則為生物信息學分析流程,盡管目前已有大量用于生信分析的軟件,但不同軟件在算法上存在諸多差異,未來最好能夠開發出一套專門針對魚類eDNA高通量測序數據處理的軟件與分析流程[144]。相信通過對eDNA技術的分析流程進行標準化之后,將能夠使eDNA研究結果的精確性得到極大的提升。

4.2 參考數據庫的缺乏

在eDNA技術成為主流的魚類資源調查方法之前,尚有許多方法論上的困難需要克服[65],其中之一便是DNA序列參考數據庫的不完全以及現有的數據庫中存在諸多錯誤信息[22]。目前,eDNA研究中常用的公共參考數據庫主要有NCBI的基因數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、歐洲分子生物學實驗室的數據庫(EMBL)(http://www.ebi.ac.uk/embl)、生命條形碼數據庫(BOLD)(http://v4.boldsystems.org)、漁業生物條形碼計劃在線數據庫(FISH-BOL)(http://www.fishbol.org)以及日本的魚類線粒體基因組數據庫(MitoFish)(http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp)等。然而,鑒于上述數據庫中大量錯誤信息的存在與魚類12s rRNA基因序列的極度匱乏,科研人員逐漸意識到建立本土魚類基因數據庫的重要性,且現已有相關研究證明相較于公共數據庫而言,本土魚類基因數據庫能提供更加精確的物種分類注釋信息,對eDNA研究結果精確性的提高具有十分重要的意義[31,145]。

為了解決上述數據庫不完全的問題,科研人員在利用傳統方法進行魚類資源調查時應盡可能廣泛地收集構建魚類基因數據庫所需的魚類組織材料,以確保構建的數據庫能夠在最大程度上涵蓋某海域或流域的魚類物種信息。同時,為了保障數據庫的精確性,數據庫中應包含每個魚類物種的樣品采集信息、分類鑒定信息以及DNA條形碼信息,尤其是對于那些形態學上較難辨認的物種要格外注意。此外,關于數據庫構建過程中條形碼擴增片段的選擇方面,作者建議最好能夠建立魚類線粒體全基因組數據庫以滿足不同研究的需求,即便是出于成本的考慮只能構建單基因片段的數據庫,那么也應該建立能夠覆蓋該目的基因全部序列的長片段DNA條形碼數據庫[23]。盡管擁有一個盡可能完善且精確的本土魚類DNA條形碼數據庫將能夠極大地提高eDNA研究結果的精確性,但本土數據庫同時也存在一個嚴重的缺陷——物種的覆蓋度較低,這說明在研究中如果僅使用本土數據庫進行物種的分類注釋,將無法檢測到數據庫中尚未涵蓋的某些處于入侵早期的魚類物種信息[144],從而也會對研究結果的精確性產生一定的影響。因此,為了能夠取得最佳的研究效果,在進行高通量測序數據的物種分類注釋時最好能夠同時利用公共數據庫與本土數據庫。

4.3 eDNA被釋放后生態學過程的探究

eDNA的生態學過程(圖3)主要包括eDNA在環境中的來源、狀態、遷移以及最終的結局[146]。eDNA的生態是一系列物理、化學以及生物相互作用的過程,在此過程中影響eDNA監測結果精確性的因素主要包括各類生物因素與非生物因素。

圖3 eDNA的生態Fig.3 The ecology of eDNA

魚類群落中種群數量的大小、所處的生活史階段、新陳代謝狀況、捕食者的存在以及各類洄游等均會影響環境中可檢測的eDNA信號強度[23]。Maruyama等設計室內對照組實驗研究發現由于代謝活動方面的差異,幼魚較成魚有更高的eDNA釋放率[147]。然而,在自然水域中魚類種群結構復雜且利用eDNA技術無法判別種群結構信息,這將導致利用eDNA技術無法準確地推算魚類種群的生物量。此外,Jo等發現魚類生物量的大小也會影響eDNA的釋放效率[148],而魚類的集群以及各種類型的洄游往往會導致魚類種群生物量的驟增,這也會對eDNA監測結果的精確性產生一定的干擾。因此,為了能夠使eDNA技術的監測結果更具說服力,在后期的研究中加強魚類eDNA釋放速率方面的研究十分必要。

除上述生物因素外,環境中的非生物因素也會嚴重影響eDNA的監測結果。據當前的研究表明,影響魚類eDNA監測效率的非生物因素主要包括水溫、pH、紫外光照、鹽度、渾濁度以及水文條件等,例如Strickler等探究了紫外光照、溫度以及pH對eDNA在水體中存留時間的影響,并發現eDNA在黑暗、低溫且偏堿性的水環境中能夠存留的時間更久[15],而Diaz-Ferguson和Moyer則發現水文條件的變化會影響eDNA在水環境中的分布情況[149]。盡管目前已有大量關于非生物因素對eDNA監測結果影響的方面的研究,但基本上是基于室內控制實驗且在實驗設計中僅考慮了部分環境因子對eDNA生態的影響,這與自然水體中eDNA生態的真實情況還存在一定的差距。因此,探究所有對eDNA的生態有影響的非生物因子如何綜合影響eDNA的研究結果將是科研人員未來應該重點關注的方向。

針對上述eDNA在環境中的生態學過程會對研究結果精確性產生影響這一問題,作者建議在后期的研究中應充分發揮多學科交叉融合研究的作用,綜合運用各種生態學以及水文學模型進一步闡明eDNA的生態學過程。此外,研究人員在具體的研究中應充分考慮eDNA的生態學過程可能會對研究結果所帶來的影響,并在前期的實驗方案設計與后期的實驗結果解釋時將其納入[136,146],從而將eDNA的生態學過程對研究結果精確性的影響降至最低。

5 總結及前景展望

自eDNA技術被引入水生生態系統的研究領域以來,經過十多年的發展其已經成為了一種強有力的魚類資源調查手段。目前,eDNA技術已經在物種監測、魚類多樣性監測、生物量評估以及魚類繁殖活動監測等方面得到了廣泛的應用且表現出極大的潛力。同時,相較于傳統的魚類監測方法而言,eDNA技術在監測效率、時間與經濟成本以及對生態系統的干擾等方面更具優勢。然而,由于eDNA技術在操作流程上的不規范、物種注釋參考數據庫的不完善以及eDNA被釋放進入環境之后生態學過程的不明確等原因,科研人員在應用eDNA技術進行魚類監測時所得研究結果的精確性將會受到一定的影響。因此,未來要想使eDNA技術能夠成為一種替代傳統方法的常規化魚類監測手段還需要克服很多困難。

在本文中,綜述了eDNA技術在魚類生態學研究領域中的應用現狀,同時對eDNA在具體應用中所面臨的問題與挑戰做了相關總結,并提出了相應的解決方案。最終,通過對eDNA技術在魚類生態學研究領域中相關文獻的梳理可發現,在未來的研究中要想使eDNA調查得出的結果具有更高的可信度,科研人員應聚焦于以下幾個方面:(1)不斷完善魚類mtDNA 12s rRNA基因數據庫的構建。當前利用eDNA技術進行魚類生態學的研究中,業內普遍認為以12s rRNA基因作為目的基因能夠獲得的物種鑒別效果最佳,而在全球范圍內該基因的條形碼數據庫極度匱乏,嚴重影響了高通量測序數據物種注釋結果的精確性。因此,未來亟需構建全球各地的本土魚類12s rRNA基因參考數據庫。(2)闡明eDNA的生態學過程。eDNA的生態學過程一直以來都是影響eDNA監測結果精確性的重要原因之一,盡管當前已有大量科研人員在該方面做了許多工作,但尚無明確的定論,未來應考慮多學科交叉并結合各種水文學以及生態學模型全面綜合的考慮各種影響eDNA生態過程的生物與非生物因素,進一步闡明eDNA在不同生態系統中的生態學過程。(3)開發魚類eDNA研究的生物信息學分析流程。當前用來分析魚類eDNA宏條形碼測序數據的主流軟件最初大多是專門針對微生物研究而開發的,且不同的軟件在算法上存在一定的差異,從而會在一定程度上影響最終的分析結果。因此,未來科研人員應開發一套專門針對魚類eDNA研究的生物信息學分析流程,盡可能的降低不同研究中測序數據在分析過程中因算法導致的差異。(4)不斷開發新技術,早日實現eDNA監測自動化。近年來關于eDNA采樣的各種新型設備層出不窮,甚至某些在線監測設備已經被投入使用,但上述有關設備在許多方面仍不完善,得到的監測結果并不具備很強的說服力。科研人員未來可加強在監測設備開發方面的研究,爭取早日開發出能夠放置在各種水生生態系統中自動監測并上傳魚類生態學數據的儀器設備,以實現魚類eDNA監測的自動化。