超聲輔助低共熔溶劑提取五味子中木脂素類化合物的工藝

馬曉星，韓翠艷，朱文全，梁桂林，袁橙*

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市第一醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

0 引言

低共熔溶劑(deep eutectic solvents, DESs) 是一種含有至少一個氫鍵受體(HBA，包括氯化膽堿、甜菜堿、氯化銨、甲基三苯基溴化磷等)和一個氫鍵供體(HBD，包括可再生羧酸、多元醇、糖等)的共晶混合物[1]。與傳統(tǒng)溶劑相比，DESs 顯示出了一些環(huán)境和經(jīng)濟上的優(yōu)勢，包括可調(diào)黏度、高生物降解性、低毒性、對極性和非極性化合物的高萃取能力，并且DESs 是多元體系，可以任意組合，制備方法簡單，容易存儲，更容易選擇適宜的組分，在很多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[2-6]。

五味子(五梅子)因其具有五味(咸、甜、酸、辣、苦)而得名。在中國的文化中，五味子作為藥材已經(jīng)使用了數(shù)千年。五味子被《中國藥典》正式列為鎮(zhèn)靜補劑。其中的五味子木脂素已被證明具有多種生物活性，如：肝保護(hù)作用[7]、強抗氧化特性[8]、抗癌活性[9]等。

然而，傳統(tǒng)的醇提或水提仍用于五味子生物活性成分的提取[10-12]，存在使用大量昂貴、易燃、難以去除和有毒的有機溶劑和萃取率低的缺陷。因此，本研究重點考察了氯化膽堿基DESs 的合成及其在木脂素類化合物提取中的潛力，并首次在超聲輔助下從五味子中提取生物活性化合物，為從天然植物中生理活性化合物的提取提供綠色溶劑和新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子果實采自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥園；五味子醇甲對照品110764-201915、五味子酯甲對照品111529-201706、五味子甲素對照品110857-201815、五味子乙素對照品110765-201813(中國食品藥品檢定研究院)、氯化膽堿、乙二醇、乳酸、1，4-丁二醇、蘋果酸、尿素、丙二酸、色譜甲醇。

高效液相色譜儀、超聲機、微波爐、離心機、電子天平、水浴鍋。

1.2 實驗方法

1.2.1 DESs 的制備

將氯化膽堿和乙二醇(乳酸、1,4-丁二醇、蘋果酸、尿素、丙二酸)按一定摩爾比混合于圓底燒瓶中。水浴鍋加熱到80 ℃，磁力攪拌(100 r/min)，一直加熱攪拌到澄清透明狀態(tài)，待冷卻后裝瓶常溫保存(如表1 所示)。

表1 不同體系DESs

1.2.2 木脂素得率測定方法的建立

采用高效液相色譜檢測五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等四種活性化合物的得率。色譜柱 Agilent Eclipse XDB C18Column (250×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(70∶30)；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長254 nm。分別精密稱取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素對照品10 mg 置于10 mL 容量瓶中，分別加甲醇定容制成濃度約為1 mg·mL-1的溶液，再稀釋成不同濃度的對照品溶液，微孔濾膜(0.45 μm)過濾于離心管中封口保存，分別記錄不同溶液的濃度，待檢測，繪制標(biāo)椎曲線。

五味子醇甲等四種活性化合物線性回歸方程相關(guān)系數(shù)分別為：

1.2.3 五味子木脂素的提取

分別稱取五味子粉末1.00 g 放入50 mL 錐形瓶中，再分別加入10 mL(含水量20%) 的氯化膽堿型低共熔溶劑(料液比1∶10)，攪拌混合均勻后用封口膜封口，放入超聲機中超聲時間40 min、超聲溫度50 ℃、超聲功率600 W。超聲提取后，取出放入離心管中離心10 min(10 000 r/min)取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)過濾于離心管中封口保存，作為供試品溶液。

1.2.4 DESs 的篩選

使用表1 中的DESs 提取五味子木脂素，按上述色譜條件檢測，記錄每個DES 下五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的峰面積，根據(jù)各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得率比較，篩選最佳的DES。

1.2.5 物理輔助方法的篩選

分別采用超聲法、微波法、負(fù)壓空化法、回流法輔助最佳的DESs 提取木脂素，記錄每種物理輔助方法下五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素的峰面積，根據(jù)各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得率比較，篩選最佳的物理輔助方法。

1.2.6 單因素實驗

本研究分別從含水量、料液比、超聲溫度、超聲時間和超聲功率5 個因素考察最佳DES 的提取條件。含水量分別設(shè)定為10%、20%、30%、40%、50%；料液比分別設(shè)定為1∶8、1∶10、1∶12、1∶15；超聲溫度分別設(shè)定為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃；超聲時間分別設(shè)定為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min；超聲功率分別設(shè)定為420 W、480 W、540 W、600 W。以總木脂素的提取量為評價指標(biāo)，選出較好的提取條件，平行測定3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 DESs 的確定

不同體系的DESs 具有不同理化性質(zhì)，比如溶解性、極性、密度、黏性等，會不同程度的影響提取五味子木脂素類化合物。本實驗比較了氯化膽堿與不同類型的氫鍵供體制備的不同DES 體系對提取木脂素得率的差異，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，提取五味子木脂素類化合物的最佳低共熔溶劑體系是氯化膽堿-乳酸(1∶1)，總木脂素得率達(dá)到13.06 mg/g。可能是因為氯化膽堿-乳酸(1∶1)DES 與木脂素的作用力較強，有助于目標(biāo)成分的溶出。

圖1 不同種類DESs 對五味子木脂素提取率的影響

2.2 物理輔助方法的確定

不同物理輔助方法對五味子木脂素類化合物得率如圖2 所示，總木脂素得率大小為超聲法> 微波法> 回流法> 加壓法，篩選出提取五味子木脂素類化合物的最佳物理輔助提取方法是超聲法，總得率為13.06 mg/g。

圖2 不同物理輔助方法對總木脂素得率的影響

2.3 單因素實驗結(jié)果

2.3.1 含水量對木脂素得率的影響

在DESs 中，加水是降低黏度和調(diào)節(jié)化合物溶解度的有效方法。然而，由于水具有較強的極性，高的含水量會破壞HBD、HBA 和目標(biāo)化合物之間平衡的相互作用。由圖3(a)可知，隨著低共熔溶劑的含水量增加，木脂素的總提取得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)含水量達(dá)到20% 時，提取得率最高。

圖3 單因素實驗結(jié)果

2.3.2 料液比對木脂素得率的影響

料液比會對萃取化合物有一定的影響。萃取劑不足會導(dǎo)致提取效果不佳，而過量時則會造成提取劑的浪費，甚至對提取效果不利。從圖3(b) 中可以看出，當(dāng)料液比為1∶8～1∶10 時，木脂素的總提取率先緩慢增加，當(dāng)料液比1∶10～1∶15 時，提取得率逐漸下降。隨著料液比的增加，加大了五味子與低共熔溶劑之間的接觸面積，使得五味子粉末充分侵潤，增強了木脂素類成分向低共熔溶劑的擴散，這就提高了木脂素類成分的得率。若當(dāng)料液比過大，料液的接觸面積達(dá)到了飽和，受到的超聲作用減少。

2.3.3 萃取溫度對木脂素得率的影響

由圖3(c)可知，隨著提取溫度的升高，木脂素的總提取得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)超聲溫度為50 ℃時，提取得率達(dá)到最高。溫度升高可加速傳質(zhì)擴散，降低溶劑黏度，表面張力會降低，擴散性會增加，有利于萃取分離。并且適當(dāng)?shù)纳邷囟瓤梢蕴峁└嗟臒崃亢蛙浕参锝M織，使目標(biāo)化合物更容易擴散到萃取介質(zhì)中，提高萃取率。然而，過高的溫度也會增加能量消耗，破壞一些熱敏性化合物的穩(wěn)定性，從而降低提取效率。

2.3.4 萃取時間對木脂素得率的影響

一般來說，提取在短時間內(nèi)完成，提取時間過長會增加成本，甚至不利于提取。由圖3(d) 可知，隨著超聲時間的增加，木脂素的總提取得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)超聲時間達(dá)到40 min 時，提取的效果最好得率最高。超聲波的時間越長，產(chǎn)生的能量越高，在提取溶劑中形成的空化效應(yīng)越大，提取得率越高。但是當(dāng)超聲時間過長，使得提取溶劑的揮發(fā)以及木脂素的降解，導(dǎo)致提取得率的降低。

2.3.5 超聲功率對木脂素得率的影響

萃取過程的超聲功率是研究的一個重要參數(shù)，因為其不僅可以最大限度地提高提取物中生物活性化合物的濃度，而且可以最大限度地降低提取過程的能量成本。如圖3(e)所示，在將超聲功率從420 W增加到540 W 的過程中，對總木脂素的產(chǎn)率沒有顯著影響，但當(dāng)超聲功率達(dá)到600 W 時，總木脂素的產(chǎn)率較之前顯著提高。隨著超聲功率的增加，空化效應(yīng)更強，分子的運動速度和加速度增加，分子的擴散速度更快，超聲對細(xì)胞壁的斷裂效應(yīng)更強，木脂素的溢出率增加。

3 結(jié)語

本研究以DESs 氯化膽堿類DESs 為提取溶劑對五味子中木脂素進(jìn)行超聲輔助提取，確定了萃取效果最佳的DES 為氯化膽堿-乳酸(1∶1)。單因素考察實驗結(jié)果表明最佳工藝條件：料液比為1∶10；含水量20%；超聲溫度50 ℃；超聲時間40 min；超聲功率600 W。在此條件下測得的木脂素類化合物總得率是13.06 mg/g。超聲輔助提取五味子木脂素類化合物具有操作簡單、成本低廉、綠色環(huán)保等優(yōu)點，本研究為五味子木脂素類化合物的開發(fā)利用提供一定的技術(shù)支撐和理論依據(jù)。