circ_BIRC6靶向miR-363-3p調(diào)控胃癌細胞增殖、遷移和凋亡

韓興瑞 楊柳 姚世新

(臨清市人民醫(yī)院普外科,山東 臨清 252600)

胃癌發(fā)病率、死亡率分別在惡性腫瘤排行榜居第五位、第三位〔1〕。盡管胃癌發(fā)病率有所降低,但高惡性程度和早期轉(zhuǎn)移仍是導致預后差的重要原因。識別胃癌進展中的潛在分子靶點可為胃癌的診療提供思路。非編碼RNA(ncRNA)可在多個水平上調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)基因表達,在癌癥生物學中起著關(guān)鍵作用〔2〕。不同類型的ncRNA如環(huán)狀RNA(circRNA)可與miRNA相互作用調(diào)節(jié)癌細胞生物學行為〔3〕。研究報道circRNA桿狀病毒IAP重復序列蛋白(circ_BIRC)6在肝癌中表達增加,敲低circ_BIRC6表達可減少肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力,circ_BIRC6可能作為肝癌預后標志物和治療靶點〔4〕。miR-363-3p是circ_BIRC6的潛在靶點。miR-363-3p已被報道影響胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移,并與多種腫瘤的診斷和預后有關(guān)〔5～7〕。但circ_BIRC6靶向miR-363-3p調(diào)控胃癌進展尚未見報道。本研究通過分析circ_BIRC6在胃癌中表達水平,并以miR-363-3p為切入點探討其在胃癌進展中的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1組織來源 以2018年7月至2019年12月在臨清市人民醫(yī)院接受根治性手術(shù)的37例胃癌患者的胃癌組織和與其對應的正常癌旁組織為研究對象。其中男22例,女15例,年齡32～75歲,平均(62±6.15)歲。組織立體后,立即置于液氮中冷凍,后在-80 ℃下儲存。所有入組患者經(jīng)病理證實為胃癌,其在術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療。實驗前,所有患者簽署知情同意書,并獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2細胞和試劑 人胃癌細胞HGC-27、人正常胃黏膜細胞GES-1購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心;總RNA提取試劑盒、FastQuant逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Select Master Mix購自北京天根生化科技公司;重組熒光素酶報告載體、si-NC、si-circ_BIRC6、miR-NC、miR-363-3p、anti-miR-363-3p、anti-miR-NC購自北京六合華大基因公司;細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購自南京建成生物工程研究所;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物公司;Transwell小室購自美國Corning公司。

1.3細胞培養(yǎng) 將HGC-27細胞、GES-1細胞分別接種于RPMI1640培養(yǎng)基中,加入10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗,放入37 ℃、含5%CO2溫箱孵育,細胞長滿培養(yǎng)瓶的80%時進行消化傳代。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測circ_BIRC6和miR-363-3p表達 總RNA提取試劑盒提取組織樣本、HGC-27細胞、GES-1細胞的總RNA。用FastQuant逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,再用SYBR Select Master Mix進行RT-qPCR以分析circ_BIRC6和miR-363-3p表達。GAPDH、U6分別作為circ_BIRC6、miR-363-3p檢測時的內(nèi)參基因,2-△△Ct法計算circ_BIRC6、miR-363-3p表達量。實驗引物如下:circ_BIRC6上游引物:5′-TGAAAGGTTCTTGCACGCAT-3′,下游:5′-TGA AAGGTTCTTGCACGCAT-3′;GAPDH上游引物:5′-CAGAACATCATCCCTGCCTCTAC-3′,下游:5′-ATGAAGTCAGAGGAGACCACCTG-3′;miR-363-3p上游引物:5′-GCCGAGAATTGCACGGTAT-3′,下游:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6上游引物:5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,下游:5′-AAATATGGAACGCTTC-ACGA-3′。

1.5實驗分組 將對數(shù)期HGC-27細胞以2×104個/孔的密度接種24孔板,在細胞鋪滿培養(yǎng)板底部50%時用Lipofectamine2000將40 nmol/L寡核苷酸轉(zhuǎn)染至HGC-27細胞。根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同將HGC-27細胞共分為si-NC組、si-circ_BIRC6組、miR-NC組、miR-363-3p組、si-circ_BIRC6+anti-miR-NC組和si-circ_BIRC6+anti-miR-363-3p組。

1.6CCK-8法檢測細胞增殖 將轉(zhuǎn)染細胞以5×103個/孔的密度接種96孔板,培養(yǎng)48 h后吸盡培養(yǎng)液,每孔加入10 μl CCK-8試劑和90 μl完全培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育2 h,在酶標儀上測量450 nm處的吸光度(A)。抑制率(%)=(1-實驗A/對照A)×100%。

1.7流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h細胞,加入1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細胞密度為2×105個/ml。取500 μl細胞懸液加入流式管,依次加入Annexin V-FITC(5 μl)、碘化丙啶(5 μl)避光染色20 min。混勻細胞,通過流式細胞術(shù)評估細胞凋亡情況。

1.8平板克隆實驗檢測細胞克隆能力 將轉(zhuǎn)染48 h以2×102個/孔的密度接種在直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中,輕旋平板使細胞分散均勻。放入培養(yǎng)箱孵育,中間適時換液,孵育10～12 d當出現(xiàn)時細胞集落時終止培養(yǎng)。磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后,用4%多聚甲醛固定細胞集落,0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計數(shù)>50個細胞的集落數(shù)。

1.9Transwell實驗檢測細胞遷移 將轉(zhuǎn)染48 h細胞懸浮在無血清培養(yǎng)基中調(diào)整細胞密度為2×105個/ml。每組取200 μl細胞懸液加至Transwell小室的上室,同時將含有10%胎牛血清的600 μl培養(yǎng)液加至下室。放入培養(yǎng)箱孵育24 h,用甲醇固定穿膜細胞,用0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下觀察、計數(shù),取5個視野細胞數(shù)均值表示細胞遷移數(shù)量。

1.10雙熒光素酶報告實驗 將含有miR-363-3p結(jié)合位點的circ_BIRC6野生型(WT)序列及不含上述位點的突變型(MUT)序列分別克隆到pGL3熒光素酶載體中,獲得重組載體WT-circ_BIRC6和MUT-circ_BIRC6。用Lipofectamine2000將重組載體分別與miR-363-3p mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染HGC-27細胞。用雙熒光素酶報告基因檢測轉(zhuǎn)染48 h細胞的熒光素酶活性值。

1.11統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1circ_BIRC6和miR-363-3p在胃癌組織、細胞中的表達 與癌旁組織(0.80±0.13)比較,胃癌組織中circ_BIRC6表達水平(2.27±0.21)顯著升高(t=36.204,P<0.05);與癌旁組織(1.02±0.14)比較,胃癌組織中miR-363-3p表達水平(0.57±0.10)顯著降低(t=15.910,P<0.05)。與人正常胃黏膜細胞(0.34±0.05)比較,胃癌HGC-27細胞中circ_BIRC6表達水平(1.00±0.00)顯著升高(t=39.600,P<0.05);與人正常胃黏膜細胞(9.27±0.21)比較,HGC-27細胞中miR-363-3p表達水平(4.04±0.15)顯著降低(t=60.800,P<0.05)。

2.2下調(diào)circ_BIRC6對HGC-27增殖、凋亡、遷移的影響 與si-NC組比較,si-circ_BIRC6組HGC-27細胞中circ_BIRC6表達水平顯著下降(P<0.05)。與si-NC組比較,si-circ_BIRC6組HGC-27細胞抑制率、凋亡率顯著升高,克隆形成數(shù)、遷移細胞數(shù)顯著減少(均P<0.05)。見表1和圖1。

圖1 下調(diào)circ_BIRC6誘導HGC-27凋亡

表1 下調(diào)circ_BIRC6對HGC-27增殖、凋亡、遷移的檢測

2.3circ_BIRC6靶向調(diào)控miR-363-3p Starbase預測到circ_BIRC6序列中存在miR-363-3p的結(jié)合位點,見圖2。與miR-NC組比較,轉(zhuǎn)染miR-363-3p降低了HGC-27細胞中WT-circ_BIRC6的熒光素酶活性(P<0.05),而對MUT-circ_BIRC6的熒光素酶活性無顯著影響,見表2。與si-NC組(1.00±0.00)比較,si-circ_BIRC6組HGC-27細胞miR-363-3p表達水平(3.56±0.21)顯著升高(t=36.571,P<0.05)。

圖2 circ_BIRC6和miR-363-3p的互補序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

2.4miR-363-3p對HGC-27增殖、凋亡、遷移的影響 與miR-NC組比較,miR-363-3p組HGC-27細胞中miR-363-3p表達水平、細胞抑制率、凋亡率顯著升高,克隆形成數(shù)、遷移細胞數(shù)顯著減少(均P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 miR-363-3p誘導HGC-27凋亡

表3 miR-363-3p對HGC-27增殖、凋亡、遷移的影響

2.5抑制miR-363-3p逆轉(zhuǎn)下調(diào)circ_BIRC6處理的HGC-27增殖、凋亡、遷移的影響 與si-circ_BIRC6+anti-miR-NC組比較,si-circ_BIRC6+anti-miR-363-3p組HGC-27細胞miR-363-3p表達水平、細胞抑制率、凋亡率顯著降低,克隆形成數(shù)、遷移細胞數(shù)顯著增加(均P<0.05)。見表4、圖4。

圖4 抑制miR-363-3p可減弱下調(diào)circ_BIRC6對HGC-27凋亡的誘導作用

表4 抑制miR-363-3p可逆轉(zhuǎn)下調(diào)circ_BIRC6對HGC-27增殖、凋亡、遷移的作用

3 討 論

circRNA已被證實參與胃癌的不同生物學過程,并作為致癌或抑癌因子調(diào)控胃癌進展。研究報道circ_0032627在胃癌中高表達顯著增加癌細胞增殖能力〔8〕。circ_0000190在胃癌中低表達,其異位表達可誘導細胞凋亡和周期阻滯,抑制細胞遷移,抑制胃癌進展〔9〕。本研究結(jié)果提示,circ_BIRC6可能在胃癌中發(fā)揮功能。既往研究顯示肝癌中circ_BIRC6表達增加,紫杉醇通過下調(diào)circ_BIRC6表達來抑制細胞增殖和加速細胞凋亡,從而抑制肝癌的發(fā)生〔10〕。circ-BIRC6通過與miR-4491結(jié)合并負調(diào)控miR-4491在肺癌中發(fā)揮增殖、遷移抑制和凋亡促進作用〔11〕。本研究功能分析顯示,轉(zhuǎn)染si-circ_BIRC6下調(diào)circ_BIRC6表達后HGC-27細胞的增殖、遷移和克隆能力均受到抑制,而細胞凋亡率顯著增加,這與下調(diào)circ_BIRC6在肝癌、肺癌中的抑制作用相似〔4,11〕,表明circ_BIRC6在胃癌進展中起著致癌作用。

circRNA已被證實主要通過吸附miRNA在癌癥發(fā)展中發(fā)揮作用。例如,circ_100269通過靶向下調(diào)miR-630來抑制胃癌進展〔12〕。circ_100782可與miR-574-3p相互作用,下調(diào)抑癌基因Rb表達水平,從而促進胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移〔13〕。本研究檢測miR-363-3p在胃癌組織、細胞中表達較低,并通過雙熒光素酶報告基因檢測證實miR-363-3p是circ_BIRC6的直接靶點。研究報道m(xù)iR-363-3p低表達與肺癌細胞吉西他濱耐藥有關(guān)〔14〕,過表達miR-363-3p通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化可抑制肺癌細胞遷移和侵襲〔15〕。miR-363-3p還可與lncRNA FEZ家族鋅指1反義RNA1(FEZF1-AS1)相互作用,并介導沉默F(xiàn)EZF1-AS1對胃癌干細胞增殖、遷移的抑制作用,降低其體內(nèi)致瘤能力〔16〕。下調(diào)circRNA鈣黏蛋白相關(guān)蛋白基因(circCTNNA1)可上調(diào)miR-363-3p表達水平,抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、周期進展和轉(zhuǎn)移〔17〕。本研究結(jié)果與之前報道m(xù)iR-363-3p的抑癌作用吻合〔18〕。過表達miR-363-3p和下調(diào)circ_BIRC6的抗胃癌作用相似,下調(diào)circ_BIRC6表達可促進miR-363-3p表達,這提示下調(diào)circ_BIRC6在胃癌的作用可能依賴于miR-363-3p表達增加。本研究結(jié)果表明,下調(diào)circ_BIRC6通過上調(diào)miR-363-3p表達來減少胃癌細胞增殖、遷移并促進細胞凋亡。