基于melusin/Akt通路探究調控GDF-15對急性心肌梗死模型大鼠的干預效果

邵明君 黃翠翠 王巖 高遠

(1滕州市中心人民醫院急診科,山東 棗莊 277500;2棗莊科技職業學院)

急性心肌梗死(AMI)是指冠狀動脈血管發生急性狹窄和閉塞,引起心肌細胞缺血缺氧及壞死,涉及多個生物學環節,一系列生物信號通路參與調節〔1,2〕。生長分化因子(GDF)-15作為轉化生長因子(TGF)-β超家族中的一分子,對于缺血性心臟病有一定的保護作用,GDF-15能夠修復缺血、再灌注損傷后的心肌〔3〕。且相繼有臨床研究指出,GDF-15能夠作為多種心源性疾病的診斷及預后指標〔4〕。有研究發現,GDF-15具有調節脂質代謝、抑制內皮細胞凋亡、抑制炎癥細胞浸潤等作用〔5〕。然而,目前已有的臨床和基礎研究結果僅能證實GDF-15能夠改善血管閉塞引起的心肌缺血,對AMI的干預效果尚未明確〔6〕。melusin是一種胞內肌特異性表達蛋白,是一種特殊的生物應力感受器,可能通過調節下游信號Akt的磷酸化等調節心臟功能,對于melusin/Akt通路在AMI中的基礎研究較少〔7～9〕。基于此,本研究對AMI大鼠采用GDF-15進行干預,探究其臨床指標及其與melusin/Akt通路的關系。

1 材料與方法

1.1材料 選取35只清潔級SD雄性大鼠,8～10周齡,平均(8.55±0.95)周齡,體質量180～220 g,平均體質量(190.00±19.00)g,購自上海杰思捷公司,動物編號:SYXK(滬)2017-0037,大鼠均常規飼養,自由飲食飲水,溫度適宜,濕度在50%左右。

1.2AMI模型〔10〕制備 采用結扎左冠狀動脈前降支的方法制作AMI大鼠模型。27只大鼠于造模前正常飼養2 w,術前禁食12 h。根據大鼠體質量給予一定劑量的10%水合氯醛進行麻醉。嚴格控制劑量,避免因劑量而致大鼠死亡。麻醉成功后,固定手術臺,將心電圖導聯與大鼠連接,用去毛器在大鼠左胸部進行備皮、消毒,隨后用手術刀在3～4肋間作一橫切口,分離肋間肌肉,鈍性開胸后,輕輕擠壓右胸壁,暴露心臟,找出左前降支,在室間溝左心耳的下方2～3 cm處,對前降支進行穿針結扎,迅速將心臟放回胸腔,關閉胸腔,擠出胸腔內的氣體,密切觀察大鼠生命體征及心電圖的變化,根據大鼠心電圖的變化確認造模成功后將胸壁縫合。術后注射3 d青霉素預防感染。造模成功后,將大鼠放回籠子,注意保暖,密切觀測大鼠的生命體征。造模成功標準:前降支結扎成功的大鼠,可見Ⅱ導聯的ST段呈弓背向上抬高,持續30 min以上,可以確認造模成功;除此之外,結扎后的心肌顏色變為白色或發紺,以及心電圖出現高聳的R、T波,也可以判定造模成功,共計成功24只大鼠。

1.3分組及干預 將大鼠隨機分為上調GDF-15組、下調GDF-15組、模型組各8只,未進行建模的8只正常大鼠作為正常組,下調GDF-15組于造模前2 d尾靜脈注射100 μl滴度為106～107的GDF-15siRNA慢病毒(GC10312K1605)進行干預。上調GDF-15組于造模前2 d尾靜脈注射100 μl滴度為106～107的GDF-15cDNA慢病毒(GC10312K1606)。GDF-15 siRNA慢病及GDF-15 cDNA慢病毒均購自廣州復能基因有限公司。模型組及正常組均給予同等體積的生理鹽水進行干預。

1.4各組心功能檢測 大鼠經30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉,采用MyLabTMSigma VET小動物彩色多普勒超聲儀(上海玉研科學儀器有限公司)檢測左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD),并計算左室短軸短縮率(LVFS)和左室射血分數(LVEF)。

1.5各組心肌酶指標檢測 采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清肌酸磷酸激酶同工酶(CKMB)、乳酸脫氫酶(LDH)含量,取大鼠腹腔靜脈血1 ml,低溫高速離心機離心,3 500 r/min離心10 min分離血清后,酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自上海紀寧實業有限公司,貨號:JN5236、JN19786,具體實驗步驟參照試劑盒說明書進行操作。

1.6各組心肌組織觀察 實驗5 d后,處死大鼠,取出其心肌組織。將其在10%甲醛溶液中固定后,石蠟包埋切片脫蠟至水,將切片同染色架放入燒杯中,自來水沖洗。切片入蘇木素染液3～5 min后,自來水洗,1%鹽酸酒精溶液分化,水洗,稀碳酸鋰水溶液藍化30 s,水洗。切片經80%乙醇脫水,入伊紅染色液染色10～30 s。調色及脫水,透明封片,鏡檢。

1.7熒光定量PCR檢測心肌組織GDF-15表達水平 大鼠處死后均取梗死區同一部位左室前壁心肌約20 mg,提取RNA。酶標儀上檢測RNA的濃度計純度后,進行反轉錄。最后進行qPCR,每個樣本重復3次。GDF-15正向引物:5'-AGTGAGTCCTTGT-GTCTCTAC-3',反向:5'-GCAGGCTGGTGATGAGTC-3′;反應條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s。

1.8Western印跡檢測melusin/Akt通路相關蛋白表達 100 mg心肌組織中加入500 μl細胞裂解液充分勻漿后置于冰上裂解30 min。3 500 r/min離心10 min,收集上清,加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)加載緩沖液,100 ℃煮沸10 min。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)轉膜。聚偏氟乙烯(PVDF)膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,加入封閉液稀釋的melusin(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)抗體,4 ℃孵育過夜。磷酸緩沖鹽溶液(PBST)洗滌3次,加入標記的二抗,室溫孵育1 h,PBST洗滌3次,電化學發光(ECL)顯影。

1.9統計學處理 采用SPSS26.0軟件進行齊性方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組GDF-15表達比較 如表1所示,與正常組比,上調GDF-15組、下調GDF-15組、模型組GDF-15表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比,上調GDF-15組GDF-15表達顯著升高,下調GDF-15組GDF-15表達顯著降低。與下調GDF-15組相比,上調GDF-15組GDF-15表達顯著升高(P<0.05)。

表1 各組GDF-15及心功能、心肌酶指標比較

2.2GDF-15對各組心功能指標的影響 如表1所示,與正常組比,上調GDF-15組、下調GDF-15組、模型組LVEDD、LVESD表達顯著較高,LVFS、LVEF表達顯著較低(P<0.05);與模型組相比,上調GDF-15組LVEDD、LVESD表達顯著較低,LVFS、LVEF表達顯著較高,下調GDF-15組LVEDD、LVESD表達顯著較高,LVFS、LVEF表達顯著較低(P<0.05)。與下調GDF-15組相比,上調GDF-15組LVEDD、LVESD表達顯著較低,LVFS、LVEF表達顯著較高(P<0.05)。

2.3GDF-15對各組心肌酶指標的影響 如表1所示,與正常組比,上調GDF-15組、下調GDF-15組、模型組CKMB、LDH表達顯著較高(P<0.05);與模型組相比,上調GDF-15組CKMB、LDH表達顯著較低,下調GDF-15組CKMB、LDH表達顯著較高(P<0.05)。與下調GDF-15組相比,上調GDF-15組CKMB、LDH表達較低(P<0.05)。

2.4各組心肌組織觀察 如圖1所示,模型組心肌纖維組織損傷較嚴重,排列不緊密且較紊亂,細胞間隙較大,形狀不規則。正常組心肌組織排列整齊、致密且清晰可見其結構,細胞間的間隙較小且均勻。上調GDF-15組心肌纖維排列較為正常,形狀尚可,心肌組織呈現出點狀壞死,下調GDF-15組心肌纖維組織嚴重損傷,排列松散、紊亂,細胞間的間隙增大,形狀怪異,呈現彌漫性。

圖1 各組心肌組織觀察(HE染色,×400)

2.5GDF-15對AMI模型大鼠melusin/Akt信號通路相關蛋白的影響 如表2、圖2所示,與正常組比,上調GDF-15組、下調GDF-15組、模型組melusin、Akt表達顯著較低(P<0.05);與模型組相比,上調GDF-15組melusin、Akt表達顯著較高,下調GDF-15組melusin、Akt表達顯著較低(P<0.05)。與下調GDF-15組相比,上調GDF-15組melusin、Akt表達顯著較高(P<0.05)。

圖2 Western印跡檢測各組melusin、Akt蛋白表達

表2 GDF-15對AMI模型大鼠melusin/Akt通路蛋白的影響

3 討 論

GDF-15能夠使心臟梗死區域血管化程度增加,改善心功能。推測可能是GDF-15抑制了血管內皮的凋亡,釋放促血管生成因子使血管內皮增生,豐富缺血區血管化,有利于缺血區內環境得到改善、提供豐富的血液供應,對于重建功能、改善心功能等具有重要的意義〔11,12〕。衛兵艷等〔13〕研究顯示,GDF-15能夠促進AMI小鼠缺血心臟的血管新生,抑制梗死及膠原纖維沉積,對改善AMI的心功能有非常積極的作用。本研究顯示,上調GDF-15其GDF-15表達較高。GDF-15的表達對于改善心肌缺血、心室重構及心力衰竭的預后具有正向作用,GDF-15濃度與冠脈側支形成呈正相關。有實驗證實,GDF-15能夠促進心肌內皮細胞增殖及成管,說明GDF-15有血管新生的作用〔14〕。本研究顯示,上調GDF-15可有效改善心功能各項指標,緩解心室舒張和收縮功能,說明上調GDF-15可改善心功能。

心肌梗死后,由于損傷心肌結構會導致心力衰竭、心室重構等并發癥的發生,因此,早期判斷心肌梗死病變極其重要〔15〕。有研究表明,心臟急性缺血時,心肌組織相關酶發生異常變化,其中LDH和CKMB為特異性最強的,因此LDH和CKMB可作為AMI特異性指標,由于組織缺血缺氧、室壁張力增加,繼而引發心肌組織壞死。釋放抗原性物質、黏附分子、補體、激肽等多種炎癥介質,誘導炎性細胞趨化,聚集于梗死部位,并釋放炎癥因子〔15,16〕。本研究顯示,上調GDF-15對LDH和CKMB表達可有效改善,促進恢復正常表達,GDF-15激活心臟成纖維細胞分泌細胞外基質成分,修復心肌損傷,抑制梗死區擴張,對心臟起保護作用,從而改善LDH和CKMB表達,降低炎癥反應〔17〕。

作為富含半胱氨酸的整合素1相關蛋白,Melusin分子量是38 kD,在心肌組織和骨骼肌中表達,melusin敲除的小鼠心臟的發育和基本功能并未影響,但melusin過表達可誘導代償性的心肌肥厚,維持了心功能,而melusin缺失促進轉變心力衰竭。有研究證實,在主動脈縮窄的患者中心功能的降低與melusin/Akt通路的表達減少具有正相關的關系〔18〕。隨著梗死范圍擴展、變薄室壁、擴張心室、室增加壁張力,激活機械應力感受器整合素,整合素將信號傳遞給胞內分子,激活一系列下游通路。melusin的信號途徑包括Akt蛋白等,這一途徑在心肌肥厚中起重要作用。上調GDF-15對大鼠急性心肌梗死及梗死后心室重構具有保護作用,可改善melusin、Akt蛋白表達,增加血液供應,在抑制心室重構和緩解心肌纖維化過程中發揮重要作用〔19,20〕。本研究顯示,上調GDF-15可上調melusin、Akt蛋白的表達,提示上調GDF-15改善AMI作用機制可能與melusin/Akt信號通路有關。

綜上所述,GDF-15上調能改善AMI大鼠心功能及心肌酶,其作用機制可能與melusin/Akt信號通路有關,為臨床AMI靶向治療提供理論依據。