lncRNA H19經BMPs/TGF-β途徑對骨質疏松老齡大鼠脂肪干細胞成骨分化的影響

黃長智 林久灶 黃聿峰 黃兆曦 柯銘鋒 陳挺霖

(寧德師范學院附屬寧德市醫院骨科,福建 寧德 352000)

骨質疏松是指以骨小梁減少、骨質改變及骨脆性增加為表現的疾病,多發于老年人群,隨著我國人口老齡化的加劇,老年骨質疏松的發病率逐漸升高,報道稱〔1〕,因骨質疏松所致的骨折和骨缺損是目前急需解決的問題。研究發現〔2,3〕,脂肪干細胞與骨髓間充質干細胞類似,均具有多向分化潛能,其可作為種子細胞用于骨質疏松的治療。長鏈非編碼RNA(lncRNA)屬于一類非編碼RNA,其參與多種生物進程,如干細胞分化、細胞增殖及包括骨質疏松在內的多種疾病的發生進展,研究認為〔4〕,在成骨分化過程中,lncRNA具有促進或抑制干細胞成骨分化的作用。lncRNA H19屬于lncRNA成員,其位于11號染色體上,研究顯示〔5〕,其對干細胞成骨分化具有正向促進作用。張傳志等〔6〕在其研究中認為,lncRNA H19參與骨質疏松的發生和進展。本研究為了更好地促進骨質疏松老齡大鼠脂肪干細胞成骨分化,做lncRNA H19轉染處理,分析轉染lncRNA H19對脂肪干細胞成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物:選取18～20月齡老齡大鼠10只,購自廣州國家實驗室〔動物許可證號SYXK(粵)2022-0285〕,體質量為500～700 g,均常規分籠飼適應喂養7 d,自由進食、飲水,室溫控制在21～25 ℃,相對濕度控制在45%～50%,光暗交替周期為12 h。操作均符合動物實驗倫理要求。主要試劑及儀器:維甲酸(深圳振強生物技術有限公司);lncRNA H19 siRNA慢病毒載體、空載體(上海吉瑪);茜素紅染色液、堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司);骨形態發生蛋白(BMP)-2、轉化生長因子(TGF)-β、Smad1、Smad2抗體(深圳海思安生物技術有限公司)。流式細胞儀(貝克曼庫爾特);倒置顯微鏡(美國BD)。

1.2骨質疏松模型構建 10只大鼠中5只作為空白組,正常喂養,另外5只每日使用70 mg/kg灌胃構建骨質疏松模型,14 d后觀察大鼠骨密度、股骨近端組織病理變化。

1.3骨質疏松老齡大鼠脂肪干細胞分離、培養 將骨質疏松大鼠處死后,沿腹股溝處切開皮膚,暴露皮下脂肪,去除筋膜組織后,取脂肪組織,將其剪碎后常規培養,接種于培養瓶內,在DMEM培養液內脂肪原代干細胞,待細胞長滿至培養瓶底75%～80%時使用酶消化法行1∶3傳代,傳至第三代備用。使用流式細胞儀測定第3代脂肪干細胞免疫表型。

1.4lncRNA H19轉染及轉染效率鑒定 將所制備的脂肪干細胞分為3組,即不做任何處理僅做細胞常規培養的對照組、轉染lncRNA H19空載體的空載組、轉染lncRNA H19 siRNA慢病毒載體的H19 siRNA組。48 h后做后續指標觀察。

使用實時熒光定量PCR法測定lncRNA H19轉染效率,提取并測定細胞RNA純度,反轉錄獲得cDNA,以cDNA為模板,做PCR擴增,擴增體系:0.4 μl lncRNA H19上游引物、0.4 μl lncRNA H19下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYB Green,加蒸餾水至20 μl。擴增條件:94 ℃預變性1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min,72 ℃延伸5 min,40個循環,采用2-ΔΔCt方法計算lncRNA H19表達量。lncRNA H19上游引物:5′-GCCTGAGTCTCTCCGTATGG-3′,下游:5′-GAAGGAAGGTGCGTTGAACA-3′;內參β-actin上游引物:5′-TCTCTGGTCCTGGGTCTTGT-3′,下游:5′-ATGGCTTGTCAAGGCAGTTTC-3′。

1.5脂肪干細胞成骨分化能力測定 以5×104個/孔的密度將細胞接種于96孔板上,固定后磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,加入2%茜素紅1 ml,避光30 min后對細胞礦化結節形成情況進行觀察,結節越多成骨能力越強。

1.6脂肪干細胞ALP染色和活性測定 以5×104個/孔的密度將細胞接種于96孔板上,24 h后使用40 g/L多聚甲醛固定,培養皿底部使用One-StepTMNBT/BCIP溶液完全覆蓋后在室溫、避光環境下孵育1 h,使用倒置顯微鏡觀察細胞ALP染色情況,同時使用ALP試劑盒測定ALP活性。

1.7成骨基因測定 使用實時熒光定量PCR法測定成骨基因RUNX2、OPN、OCN表達量,方法同1.4。RUNX2上游引物:5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′,下游:5′-GGCAGCTTCCCAGGGGTAA-3′;OPN上游引物:5′-CACCGAGACAGGATCAGAGG-3′,下游:5′-CTTTGGGACACAAGCCCGTGC-3′;OPN上游引物:5′-ACTTGCAGCGAGGTAGTGAAGA-3′,下游:5′-AACTCGTCAAGGTCCGGATTG-3′。

1.8BMPs/TGF-β信號通路蛋白測定 將脂肪干細胞裂解后提取蛋白,二喹啉甲酸(BCA)測定蛋白濃度,之后經蛋白與緩沖液以4∶1的比例混合均勻后煮沸使其變性,加脫脂奶粉,置于聚偏氟乙烯膜上,加1∶2 000稀釋的一抗(BMP-2、TGF-β、Smad1、Smad2),孵育過夜。第2天使用Tris-HCl緩沖鹽溶液清洗,加入二抗,增強化學發光法顯影,定影,獲得目標蛋白表達量。

1.9統計學分析 采用SPSS26.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1骨質疏松模型驗證 骨質疏松組骨密度較空白組明顯降低(P<0.05)。見表1。HE染色顯示,空白組骨組織形態完整,骨小梁排列整齊,結構飽滿,骨質疏松組骨小梁數量減少,排列不齊,斷裂,間隙增寬。見圖1。說明骨質疏松模型建立成功。

圖1 兩組股骨近端骨組織病理(HE染色,×200)

表1 空白組、骨質疏松組骨密度比較

2.2骨質疏松老齡大鼠脂肪干細胞培養、鑒定 鏡下觀察顯示,骨質疏松老齡大鼠第三代脂肪干細胞多為長梭形、多角形,見圖2。脂肪干細胞表面抗原CD73、CD90等陽性標志物表達較高,分別為99.80%、100.00%,CD34、CD45等陰性標志物表達較低,分別為0.23%、0.80%,提示所培養的細胞為脂肪來源干細胞。

圖2 第三代脂肪干細胞鏡下形態

2.3lncRNA H19轉染效率鑒定 H19 siRNA組lncRNA H19表達量明顯低于對照組、空載組(P<0.05),對照組、空載組比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 lncRNA H19轉染效率及lncRNA H19對脂肪干細胞ALP活性的影響

2.4lncRNA H19對脂肪干細胞ALP活性的影響 H19 siRNA組ALP活性明顯高于對照組、空載組(P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 各組ALP活性(NBT/BCIP染色,×100)

2.5lncRNA H19對脂肪干細胞成骨分化能力的影響 H19 siRNA組礦化結節較多,顏色為深紅,對照組、空載組僅有少量礦化結節,說明H19 siRNA組成骨分化能力較對照組、空白組增強。見圖4。

圖4 3組脂肪干細胞成骨分化能力(茜素紅染色,×100)

2.6lncRNA H19對脂肪干細胞成骨基因的影響 H19 siRNA組成骨基因RUNX2、OPN、OCN表達量明顯高于對照組、空載組(P<0.05)。見表3。

表3 lncRNA H19對脂肪干細胞成骨相關基因的影響

2.7lncRNA H19對脂肪干細胞BMPs/TGF-β信號通路蛋白表達的影響 H19 siRNA組BMPs/TGF-β信號通路蛋白BMP-2、TGF-β、Smad1、Smad2表達量均明顯高于對照組、空載組(P<0.05)。見表4、圖5。

圖5 3組BMPs/TGF-β信號通路蛋白表達

表4 lncRNA H19對脂肪干細胞BMPs/TGF-β信號通路蛋白表達的影響

3 討 論

骨質疏松發病率隨著年齡的增加而增加,究其原因可能與隨著年齡的增長,人體骨骼中骨質改變導致骨密度降低有關,而此病的發生本質為成骨和破骨細胞失衡〔7〕。近年來隨著臨床上對干細胞的逐漸研究發現〔8,9〕,干細胞具有較強的成骨分化作用,在移植后可抑制成骨和破骨細胞失衡,促進兩者平衡,進而增加骨密度,在骨質疏松的治療中具有較高的價值。有報道顯示〔10,11〕,骨質疏松的發生涉及多個機制,lncRNA屬長鏈非編RNA,主要分布于細胞核、細胞質內,其結構和來源與微小RNA類似,均是由RNA聚合酶Ⅱ轉錄所得,通常情況下,lncRNA在RNA水平上可經調節相關靶基因的表達而發揮作用。lncRNA H19具有促進腫瘤發生進展、細胞分化、胚胎生長的作用〔12,13〕。研究發現〔14〕,在骨質疏松發生過程中lncRNA H19可經影響成骨/破骨細胞、骨髓間充質干細胞參與骨代謝過程,其在骨質疏松中表達降低。Li等〔15〕在其報道中認為,在骨質疏松中lncRNA H19上調可促進炎癥因子的過度表達,抑制成骨細胞增殖。

目前有關lncRNA H19的研究主要以對干細胞成骨分化和成脂分化為主,在骨質疏松中其可經作用于微小RNA-532-3p/沉默信息調節因子1信號通路誘導骨髓間質干細胞成骨分化〔16〕。一項研究發現,lncRNA H19可經調控成骨相關蛋白BMP-2的表達而增強干細胞成骨分化能力〔17〕。Zhong等〔18〕報道顯示,lncRNA H19通過調控miR-140-5p和BMP-2/FGF9促進人牙髓干細胞成牙本質細胞分化。上述報道均證實,lncRNA H19具有促進干細胞成骨分化的作用,但有關lncRNA H19對骨質疏松來源脂肪干細胞成骨分化的報道較少,本研究結果說明,lncRNA H19具有促骨質疏松來源脂肪干細胞成骨分化的作用。

ALP在成骨誘導過程中最先反應,在成骨分化開始時ALP活性增加,隨著成骨分化能力的增強,其活性逐漸增加,其活性高低與成骨分化能力正相關〔19,20〕。RUNX2可影響骨/成骨細胞分化、成骨基因表達和骨形成,臨床上多根據其水平評估成骨能力〔21,22〕。OPN、OCN分別均由骨質細胞產生,參與骨吸收、骨改變,兩者水平可直接反映出骨形成狀態〔23〕。本研究結果說明,lncRNA H19具有促進脂肪干細胞成骨分化的能力。

本研究結果說明,BMPs/TGF-β可能是lncRNA H19促進脂肪干細胞成骨分化的作用途徑。研究表明,BMPs/TGF-β信號通路中BMP-2、TGF-β為信號傳遞分子,其中BMP-2屬于一種酸性糖蛋白,其主要來源于骨相關結締組織和軟骨組織,可促新骨形成〔24,25〕。TGF-β主要來源于骨基質,其參與機體骨代謝穩定和骨架維護〔26〕。研究發現〔27,28〕,TGF-β在發揮作用的過程中作用于特定配體的受體復合物Smads發揮作用,在上述作用下,Smads被激活,進而影響下游靶基因轉錄,增加ALP活性,促進成骨分化。另外BMPs/TGF-β信號通路分子BMP-2、TGF-β經共同作用于四聚體受體復合體,可同時向典型和非典型的Smads傳遞信號,進而影響成骨細胞分化、骨形成和骨穩態〔29〕。本研究發現,lncRNA H19在骨質疏松中可能經BMPs/TGF-β途徑促進脂肪干細胞成骨分化。

雖然本研究認為lncRNA H19可能經BMPs/TGF-β途徑促進RUNX2、OPN、OCN等成骨基因表達而發揮促骨質疏松老齡大鼠脂肪干細胞成骨分化的作用,但本研究并未進一步分析lncRNA H19與BMP-2、TGF-β的靶向關系,且目前臨床上有關此類的研究較少,因此還需后續研究進一步深入探討。