基于TLR4/NF-κB研究苗藥黑骨藤對(duì)AGA大鼠Th17/Treg及相關(guān)細(xì)胞因子的影響

黨榮敏 蔣催蓉 謝洪書(shū) 羅康華 姚文琴

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 1病原生物學(xué)教研室,貴州 都勻 558000;2病理學(xué)教研室;3微生物學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)教研室)

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(AGA)是由于尿酸鹽沉積在關(guān)節(jié)囊、滑囊、軟骨、骨質(zhì)和其他組織中而引起病損及炎性反應(yīng),其會(huì)發(fā)生引起沉積關(guān)節(jié)部位的劇烈疼痛,嚴(yán)重情況下會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形,造成不可逆的關(guān)節(jié)殘疾,在一定程度上對(duì)人們生活質(zhì)量造成不良影響〔1,2〕。目前臨床上治療此病以藥物治療為主,西藥具有療效不顯著、需長(zhǎng)期服藥、不良反應(yīng)較多等劣勢(shì),故尋找一種療效顯著、副作用較小的藥物仍是目前學(xué)術(shù)研究的熱點(diǎn)〔3〕。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在臨床各種疾病的療效彰顯優(yōu)勢(shì),臨床研究證實(shí),傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)不良反應(yīng)少且具有“多靶點(diǎn)、多通路”的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)〔4〕。苗藥黑骨藤具有良好的抗類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用,其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫器官功能及促進(jìn)炎細(xì)胞因子水平有關(guān)〔5〕。但目前鮮少苗藥黑骨藤在AGA中作用報(bào)道。本研究探究基于Toll樣受體(TLR)4/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB研究苗藥黑骨藤對(duì)AGA大鼠輔助性T細(xì)胞(Th)17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及相關(guān)細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1材料 研究動(dòng)物:選取90只SPF級(jí)雄性健康大鼠,由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體質(zhì)量224～249 g,平均(225.62±10.44)g,將大鼠放置室溫22～24 ℃,濕度40%～70%,12 h光照/12 h黑暗交替無(wú)病原菌干凈籠子中飼養(yǎng),飲用的水和食物均經(jīng)消毒,統(tǒng)一喂給標(biāo)準(zhǔn)飼料,允許自由活動(dòng),飼養(yǎng)1 w。主要試劑:秋水仙堿購(gòu)自西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司,國(guó)藥準(zhǔn)字:H53021369,規(guī)格:0.5 mg;白細(xì)胞介素(IL)-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海廣銳生物科技有限公司(貨號(hào):elisa2013-0424)、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)于武漢益普生物科技有限公司(貨號(hào):CK-E30646)、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒購(gòu)于上海臻科生物科技有限公司(貨號(hào):ZK-6601);TLR4抗體購(gòu)于武漢菲恩生物科技有限公司(貨號(hào):FNab08727);NF-κB抗體購(gòu)于深圳市豪地華拓生物科技有限公司(貨號(hào):PL0403111)。

1.2建模及分組 在90只SPF級(jí)雄性健康大鼠中選取15只作為正常組,其余大鼠參照薛舒月等〔6〕研究建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型,在大鼠踝關(guān)節(jié)外后方和沿著與脛骨成45 °夾角方向?qū)⒑?.2 ml MSU懸混液的5號(hào)注射器插入右踝關(guān)節(jié)腔并注入,輕揉拉伸關(guān)節(jié),幫助藥物擴(kuò)散至關(guān)節(jié)周?chē)鞑课?建模成功標(biāo)準(zhǔn):各組踝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)明顯腫脹。建模成功后將大鼠隨機(jī)分為模型組、秋水仙堿組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各15只。

1.3給藥 藥物按照10倍于60 kg人提高總折算為大鼠等效劑量,通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,苗藥黑骨藤的劑量分別為:25、50、100 mg/kg,低、中、高劑量組分別給予25、50、100 mg/kg苗藥黑骨藤灌胃,秋水仙堿組使用0.1 mg/kg的秋水仙堿灌胃,正常組、模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃,每日均在上午9點(diǎn)灌胃給藥1次,持續(xù)給藥7 d。

1.4樣本采集 在第7天灌胃2 h后股動(dòng)脈取血,分離血中單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行Th17、Treg含量測(cè)定;同時(shí)分離血清及切取關(guān)節(jié)囊、分離關(guān)節(jié)滑膜組織,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5Th17/Treg及相關(guān)細(xì)胞因子水平 采用美國(guó)BD公司Facs CantoⅡ型流式細(xì)胞儀測(cè)定Th17、Treg含量,計(jì)算Th17/Treg比值。采用ELISA測(cè)定IL-1β、IL-6、TNF-α水平,實(shí)驗(yàn)步驟按相關(guān) ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6Western印跡檢測(cè)TLR4、NF-κB蛋白表達(dá) 將蛋白緩沖液加入各組組織中并采用二喹啉甲酸(BCA)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè),隨后取10 μl蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜,隨后在其中加入適量一抗并封閉,過(guò)夜孵育環(huán)境為4 ℃,采用Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)對(duì)各組組織進(jìn)行洗滌后加入適量二抗并孵育1 h,孵育環(huán)境為室溫,對(duì)各組組織進(jìn)行洗膜并加入等體積化學(xué)發(fā)光液A液、B液與PAGE膜反應(yīng),曝光顯影,內(nèi)參蛋白為磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Th17/Treg及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 高、中、低劑量組、秋水仙堿組及模型組Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯高于正常組,Treg明顯低于正常組(P<0.05)。高、中、低劑量組、秋水仙堿組Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯低于模型組,Treg明顯高于模型組(P<0.05)。高、中、低劑量組Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯低于秋水仙堿組,Treg明顯高于秋水仙堿組(P<0.05)。高、中劑量組Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯低于低劑量組,Treg明顯高于低劑量組(P<0.05)。高劑量組Th17、Th17/Treg、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯低于中劑量組,Treg明顯高于中劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組Th17/Treg及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

2.2TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量比較 高、中、低劑量組、秋水仙堿組、模型組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.05),高、中、低劑量組、秋水仙堿組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.05),高、中、低劑量組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯高于秋水仙堿組(P<0.05),高、中劑量組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯低于低劑量組(P<0.05),高劑量組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯低于中劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

AGA作為一種遷延性濕病時(shí)刻危害著人類(lèi)健康,臨床上多采用秋水仙堿和糖皮質(zhì)激素控制患者臨床癥狀,但不可避免會(huì)出現(xiàn)大量藥物不良反應(yīng),如胃腸道反應(yīng)、腎功能不全、骨髓抑制、皮疹、脫發(fā)等,在一定程度上可緩解臨床癥狀,但復(fù)發(fā)率較高、不良反應(yīng)較大,再加之部分患者依從性差、不能堅(jiān)持服用,且到目前為止,暫無(wú)根治此病的藥物〔7～9〕。中醫(yī)在疾病治療方面積累較多經(jīng)驗(yàn)逐漸進(jìn)入研究者的視野,且越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥確實(shí)對(duì)AGA有一定療效。黑骨藤是貴州苗族地區(qū)常用藥物之一,是蘿摩科植物西南杠柳的根或全株,其味苦、辛、性溫、有小毒,具有活血消癰、祛風(fēng)除濕的功效〔10,11〕。在楊婉珠等〔12〕研究中,黑骨藤醇提取物對(duì)急性心力衰竭大鼠具有一定的保護(hù)作用,機(jī)制可能與增強(qiáng)心肌超氧化酶活性,進(jìn)而改善急性心力衰竭大叔體內(nèi)氧化應(yīng)激失衡及增強(qiáng)心臟泵血功能有關(guān)。既往研究顯示〔13〕,黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊中含有黑骨藤成分,針對(duì)西南地區(qū)高原風(fēng)寒濕氣候所誘導(dǎo)的風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者具有較好的治療效果,其中黑骨藤具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消痹止痛的功能,還具有較好的抗炎效果,但具體臨床作用機(jī)制與治療靶點(diǎn)未有深入挖掘。在本研究中,苗藥黑骨藤在AGA治療中,療效顯著,可有效降低炎性因子水平,緩解炎癥反應(yīng)。

眾多研究顯示〔14,15〕,AGA的發(fā)病關(guān)節(jié)局部伴隨一些信號(hào)通路的激活或抑制,TLR4/NF-κB是其中最重要的信號(hào)通路之一,該通路的激活、細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的大量產(chǎn)生與AGA的發(fā)病與炎癥表現(xiàn)密切相關(guān)。TLRs受體屬于模式識(shí)別受體家族,可識(shí)別病原相關(guān)分子模式,其中TLR4為該家族研究最多的分子之一。TLRs為Ⅰ型跨膜受體,當(dāng)其活化后通過(guò)TLR結(jié)合域與髓樣分化分子結(jié)合并激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)激酶,隨后結(jié)合TNF受體相關(guān)因子6活化轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1,進(jìn)而激活NK-κB〔16,17〕。NF-κB位于TLR4/NF-κB信號(hào)通路下游的重要節(jié)點(diǎn),參與調(diào)節(jié)體內(nèi)重要細(xì)胞因子、炎癥因子、黏附因子等的表達(dá),若NF-κB被激活,可促進(jìn)IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子表達(dá),產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔18,19〕。IL-1β在炎癥反應(yīng)中可促進(jìn)并招募中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,進(jìn)而引起紅、腫、熱、痛等關(guān)節(jié)炎表現(xiàn),同時(shí)釋放的炎性物質(zhì)可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL-1β,加劇炎癥反應(yīng)〔20〕。有研究顯示〔21〕,IL-1β可激活破骨細(xì)胞使其分化,還可作用于神經(jīng)元、觸發(fā)機(jī)體對(duì)炎癥所致疼痛的過(guò)度敏感;TNF-α可通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路促使IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子分泌及中性粒細(xì)胞出現(xiàn)吞噬活性并釋放氧自由基和蛋白水解酶,導(dǎo)致尿酸鹽沉積處出現(xiàn)充血、水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)且不斷加重。而研究發(fā)現(xiàn)〔22〕,AGA的發(fā)病過(guò)程中CD4+T細(xì)胞所參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的Th具有重要的作用,其亞群失衡在痛風(fēng)的發(fā)生和進(jìn)展中具有重要作用。Th17、Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞在細(xì)胞因子的刺激下分化成的兩個(gè)Th亞型,Th17細(xì)胞可分泌促炎因子,誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞分泌炎性因子和趨化因子,促進(jìn)并加重炎癥反應(yīng)的發(fā)生;Treg細(xì)胞是負(fù)相免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,通過(guò)釋放抑炎因子抑制機(jī)體過(guò)度免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)藥物干預(yù)治療后AGA大鼠TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯降低,Th17/Treg失衡被調(diào)控,且苗藥黑骨藤作用優(yōu)于秋水仙堿,呈劑量依賴(lài),推測(cè)其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)Th17/Treg平衡,抑制關(guān)節(jié)組織炎癥相關(guān)。

綜上,苗藥黑骨藤可通過(guò)下調(diào)TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)量,抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路,降低Th17/Treg及相關(guān)細(xì)胞因子水平,減輕炎癥反應(yīng),緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)展,起到治療作用。