miR-181-5p靶向PTEN/AKT/mTOR通路對氧化應激誘導下人皮膚成纖維細胞自噬及老化的影響

黃燕 楊艷清 萬睿 周進飛 胡夢

(1武漢市第三醫院整形外科,湖北 武漢 430060;2襄陽市伊萊美醫療美容門診部)

人皮膚成纖維(HDF)細胞是皮膚的主要細胞類型,主要負責細胞外基質的沉積和重塑,為皮膚提供結構的完整性和彈性〔1〕。皮膚的氧化損傷是皮膚老化的主要原因之一,而氧化損傷則是由于過多的活性氧積累引起的〔2〕。另有文獻報道,細胞老化與細胞自噬密切相關,自噬水平的降低可加速細胞老化,自噬水平的升高可以延緩細胞老化〔3〕。因此,從分子水平探究氧化應激誘導下HDF細胞自噬及老化的內部機制,對于延緩皮膚衰老具有重要的意義。MicroRNA(miRNA)是一類公認的轉錄后調節劑,屬于非編碼RNA家族,已通過靶向其自身的mRNAs被鑒定為調節細胞過程(如自噬、老化)的關鍵參與者〔4〕。研究表明,miR-181-5p參與調節細胞自噬,且是細胞老化的標志分子〔5〕。而10號染色體上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路作為參與細胞自噬的主要通路之一,可調控糖尿病大鼠腎組織中自噬水平的變化〔6〕。然而,miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路對氧化應激誘導下HDF細胞自噬及老化的影響尚未見報道。本研究探討miR-181-5p對氧化應激誘導下HDF細胞自噬及老化的影響及其內部分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞來源 HDF細胞(貨號:CE19179)購于北京科瑞思搏生物科技有限公司。

1.2主要試劑與儀器 miR-181-5p模擬物(miR-181-5p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、miR-181-5p抑制物(anti-miR-181-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)均購自美國Thermo Fisher公司;DMEM培養基、胎牛血清(FBS)均購自TaKaRa公司;CCK-8試劑盒、細胞衰老檢測試劑盒〔β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色〕均購自美國Cell Biolabs公司;二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、Lipofectamine2000轉染試劑盒均購自美國Bio-Rad公司;通用反轉錄試劑盒(MMLV)、SYBR Green qPCR Master Mix、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自美國Promega公司;PTEN、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、自噬相關蛋白(Beclin)-1、微管相關蛋白輕鏈(LC)3Ⅱ/Ⅰ兔單克隆抗體、GAPDH兔多克隆抗體(anti-PTEN、anti-AKT、anti-p-AKT、anti-mTOR、anti-p-mTOR、anti-Beclin-1、anti-LC3Ⅱ/Ⅰ、anti-GAPDH)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(羊抗兔IgG-HRP二抗)均購自美國Abcam公司;熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀、CO2培養箱均購自德國Leica公司。

1.3細胞培養及細胞老化模型的構建 將HDF細胞置于含有10%FBS和100 U/ml青霉素/鏈霉素的DMEM培養基中,并在含有5%CO2,37 ℃培養箱中進行常規培養。參照文獻〔7〕,進行細胞老化模型的構建。簡言之,取對數生長期的HDF細胞,調整細胞濃度為6×103個/ml接種于96孔板中,于5%CO2,37 ℃培養箱中培養24 h。隨后分別用含0、100、200、500 μmol/L H2O2的DMEM培養基培養HDF細胞24 h,最后通過細胞存活率確定構建細胞老化模型的適宜H2O2濃度,并將該濃度H2O2處理的HDF細胞命名為H2O2模型細胞。

1.4CCK-8法檢測HDF細胞存活率 分別收集處于對數生長期的各組HDF細胞接種至96孔板(5×103個/孔)中,加入10 μl CCK-8溶液于每個孔中,37 ℃孵育3 h,采用全自動酶標儀測定各組細胞在450 nm波長處的吸光值(OD值)。細胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.5細胞轉染 使用Lipofectamine2000試劑盒進行細胞轉染,細胞分組為:空白組(細胞未轉染)、miR-181-5p mimics組(細胞轉染miR-181-5p mimics)、miR-NC組(細胞轉染miR-NC)、anti-miR-181-5p 組(細胞轉染anti-miR-181-5p)、anti-miR-NC組(細胞轉染anti-miR-NC),然后使用含適宜H2O2濃度(200 μmol/L)的DMEM培養基培養各轉染組細胞24 h。

1.6qRT-PCR檢測HDF細胞中miR-181-5p表達水平 用Trizol試劑分別提取各組HDF細胞總RNA,使用MMLV逆轉錄試劑盒將1 μg RNA逆轉錄成cDNA,利用SYBR Green qPCR Master Mix對miR-181-5p表達水平進行定量。以U6為內參,采用2-ΔΔCt計算基因相對表達水平。所用引物序列為:U6正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;miR-181-5p正向:5′-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTC-GG-3′;反向:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

1.7Western印跡檢測蛋白表達水平 從細胞沉淀物中提取的蛋白質上樣到12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上,然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,在5%脫脂牛奶中封閉1h后,首先將膜與一抗(anti-PTEN、anti-AKT、anti-p-AKT、anti-mTOR、anti-p-mTOR、anti-Beclin-1、anti-LC3Ⅱ/Ⅰ、anti-GAPDH)在4 ℃下孵育過夜,然后加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5 000)于室溫孵育2 h。使用電化學發光(ECL)試劑可視化蛋白質,使用ImageJ軟件對灰度值進行量化分析。

1.8雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-181-5p與PTEN靶向關系 使用Starbase網站預測miR-181-5p與PTEN的結合位點。分別構建PTEN的野生型(WT)和突變型(MUT)3'-UTR區質粒,標記為WT-PTEN、MUT-PTEN。取對數生長期的HDF細胞,按照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書將WT-PTEN、MUT-PTEN分別與miR-NC或miR-181-5p mimics共轉染,轉染48 h后,通過雙熒光素酶測定系統分析熒光素酶相對活性。

1.9SA-β-gal活性測定 SA-β-gal活性上調是細胞老化的特征之一。按照SA-β-gal試劑盒檢測各組細胞SA-β-gal的表達,老化細胞經SA-β-gal染色后會變成藍色,在光學顯微鏡下計數藍色細胞及總細胞數目,可計算SA-β-gal細胞的染色率。

1.10統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1細胞老化模型的構建 隨著H2O2濃度(0、100、200、500 μmol/L)的升高,HDF細胞存活率〔(99.96±9.96)%、(70.24±7.54)%、(51.64±5.11)%、(25.43±2.03)%〕逐漸降低,且當H2O2濃度低于200 μmol/L,細胞存活率高于50%,H2O2濃度高于500 μmol/L時,HDF細胞大量死亡。其中H2O2濃度為200 μmol/L時,細胞存活率為51.64%。因此,選擇200 μmol/L H2O2作為模型的老化濃度,并將該濃度處理的HDF細胞記為H2O2模型細胞。

2.2HDF細胞中miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路相關蛋白表達 與HDF細胞相比,H2O2模型細胞中miR-181-5p及p-AKT、p-mTOR蛋白表達明顯上調,PTEN蛋白表達明顯下調(P<0.05)。見表1、圖1。

1,2:HDF細胞、H2O2模型細胞圖1 Western印跡檢測HDF細胞中PTEN/AKT/mTOR 通路相關蛋白表達

表1 HDF細胞中miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路相關蛋白表達

2.3miR-181-5p靶向調控PTEN的表達 Starbase網站預測PTEN與miR-181-5p存在結合位點見圖2。雙熒光素酶報告基因實驗結果表明,與miR-NC+WT-PTEN組(1.23±0.07)比較,miR-181-5p mimics+WT-PTEN組的熒光素酶相對活性(0.39±0.02)顯著降低(P<0.05),而miR-181-5p mimics+MUT-PTEN組(1.21±0.10)與miR-NC+MUT-PTEN組熒光素酶相對活性(1.22±0.09)差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 miR-181-5p與PTEN結合位點

2.4各轉染組細胞中miR-181-5p及PTEN/AKT/mTOR通路相關蛋白表達水平 miR-181-5p mimics組中miR-181-5p表達水平顯著高于空白組和miR-NC組(P<0.05),而anti-miR-181-5p組中miR-181-5p表達水平顯著低于空白組和anti-miR-NC組(P<0.05),證明細胞轉染成功。與空白組和miR-NC組比較,miR-181-5p mimics組中PTEN蛋白表達明顯下調,p-AKT、p-mTOR蛋白表達明顯上調(P<0.05);與空白組和anti-miR-NC組比較,anti-miR-181-5p組中PTEN蛋白表達明顯上調,p-AKT、p-mTOR蛋白表達明顯下調(P<0.05)。見圖3、表2。

1～5:空白組、miR-NC組、miR-181-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-181-5p組;圖4同圖3 Western印跡檢測各組PTEN/AKT/mTOR通路相關蛋白表達

表2 各組細胞中miR-181-5p、PTEN/AKT/mTOR通路相關蛋白表達及Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達比較

2.5miR-181-5p對各組細胞中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達的影響 miR-181-5p mimics組中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達顯著低于空白組和miR-NC組(P<0.05);而anti-miR-181-5p組中Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達顯著高于空白組和anti-miR-NC組(P<0.05)。見表2、圖4。

圖4 各組Beclin-1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達

2.6miR-181-5p對各組細胞形態及SA-β-gal活性的影響 空白組、miR-NC組、anti-miR-NC組細胞排列不規則,細胞變大,輪廓不清楚,折光性差,符合老化細胞的特征。miR-181-5p mimics組中的細胞狀態與上述類似,且比例高于空白組和miR-NC組;而anti-miR-181-5p組中大部分細胞呈長梭形,輪廓清晰,折光性好。見圖5。與空白組〔(70.59±2.33)%〕和miR-NC組〔(72.09±2.09)%〕比較,miR-181-5p mimics組SA-β-gal染色率〔(95.56±6.36)%〕顯著升高,而anti-miR-181-5p組SA-β-gal染色率〔(23.16±1.28)%〕顯著低于空白組和anti-miR-NC組〔(71.83±2.55)%;P<0.05〕。

3 討 論

在皮膚老化過程中,會出現皮膚變薄,皺紋增多,彈性變小等現象〔8〕。過度的氧化應激會破壞DNA和蛋白質結構,導致生物膜和細胞核的損傷,而細胞老化可以看作是氧化應激誘導損傷累積的過程〔9〕。miRNA廣泛參與生物體多種生理過程,包括自噬、老化。據報道,miRNA在調節細胞增殖能力和復制性老化之間的平衡中起著至關重要的作用;一些miRNA的表達與壽命直接相關,miRNA的表達可以作為年齡,壽命和過早老化的預測因子〔10〕;miR-146a的表達水平與視網膜色素上皮細胞的衰老呈正相關〔11〕;miR-663的表達水平隨年齡逐漸升高,且在老年組中的升高比率最大;miR-130a可通過調節細胞凋亡與自噬進而調控腦衰老進程;miR-181-5p在皮膚衰老的成纖維細胞中高表達〔12〕,這與本研究結果一致。本研究結果提示,過表達miR-181-5p在細胞老化過程中發揮著抑制自噬、促進細胞老化的作用,而抑制miR-181-5p具有相反作用。

為了進一步探究miR-181-5p在細胞老化過程中發揮著抑制自噬、促進老化的內部分子機制。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實PTEN為miR-181-5p的靶基因。已有研究表明,PTEN可負調控AKT/mTOR來調節自噬,PTEN/AKT/mTOR通路是參與自噬的主要信號通路之一〔13〕;在結直腸癌中,自噬標志蛋白LC3的表達與mTOR的表達呈負相關,mTOR的失活誘導了自噬的激活;非小細胞肺癌細胞自噬水平升高,而參與自噬調控的AKT/mTOR通路活性降低〔14〕。本研究結果提示,miR-181-5p可能通過靶向調控PTEN表達,進而調控AKT/mTOR通路及HDF細胞自噬,影響細胞老化。

綜上,抑制miR-181-5p可能通過靶向上調PTEN蛋白表達,抑制AKT/mTOR通路,促進自噬,進而延緩H2O2誘導的HDF細胞老化。