丹酚酸B對創傷后應激障礙大鼠神經特異核蛋白和神經生長相關蛋白43表達的影響

劉洋 陳紅蓮

(漯河醫學高等專科學校,河南 漯河 462000)

創傷后應激障礙(PTSD)是一種主要因受到應激或創傷而產生的心理障礙疾病〔1〕。除了心理層面的癥狀,PTSD患者通常伴有學習記憶能力下降〔2〕。皮層和海馬是學習和記憶形成過程中的重要腦區,同時也是創傷應激容易損傷的關鍵部位〔3〕。丹酚酸B是丹酚酸類物質中抗氧化作用最強的〔4〕。有文獻報道丹酚酸B對腦缺血再灌注損傷大鼠具有一定的改善作用〔5〕,也有研究表明丹酚酸B可以明顯提高腦缺血大鼠的學習記憶能力〔6〕,以上研究說明丹酚酸B不僅可以作用于神經系統,還對學習記憶有影響。PTSD亦屬于神經系統功能障礙性疾病,且易伴有認知功能損傷,但丹酚酸B和PTSD之間的相關研究報道比較少。本研究采用國際上認定的單次延長應激(SPS)方法建立PTSD大鼠模型,觀察丹酚酸B對PTSD大鼠認知功能的影響及可能的作用機制,以期對PTSD的治療提供有效的干預措施。

1 材料與方法

1.1試驗藥物 丹酚酸B(純度≥ 98.0%,淡黃色粉末),購自成都曼思特生物科技有限公司,批號:MUST-13082008,稱取一定量丹酚酸B粉末,加生理鹽水配制成濃度為1 mg/ml藥液備用。鹽酸帕羅西汀片購于浙江華海藥業股份有限公司,批號:H20031106,20 mg/片。

1.2動物 健康雄性SD大鼠,鼠齡2月齡,SPF級,體質量180～220 g,購于河南省實驗動物中心,動物許可證號:SCXK(豫)2017-0004。適應性飼養1 w后開始實驗。操作均嚴格按照相關規定進行。

1.3試劑 兔抗鼠NeuN多克隆抗體、兔抗鼠神經生長相關蛋白(GAP)43多克隆抗體均購自美國Sigma公司,批號分別為SAB430088、SAB4501101;Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(H+L)和Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)均購于碧云天生物技術有限公司,批號分別為A0423、A0516;超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所,批號分別為:20190322、20190326、20190219。

1.4儀器 Morris水迷宮裝置購自中國醫學科學院藥物研究所,FluoView FV1200激光共聚焦顯微鏡購自日本OLYMPUS公司,UV-2000 紫外可見分光光度計購自尤尼柯(上海)儀器有限公司,大鼠固定器購自上海玉研科學儀器有限公司。

1.5動物分組及給藥 將60只大鼠隨機分為正常組、模型組、帕羅西汀組、丹酚酸B低、中、高劑量組,每組10只。除正常組外,其余各組采用單次延長應激(SPS)構建PTSD大鼠模型。模型制備結束的次日開始丹酚酸B組每天固定時間灌胃丹酚酸B(10、20、40 mg/kg),帕羅西汀(4.2 mg/kg)組灌胃帕羅西汀,給藥體積為10 ml/kg。正常組和模型組灌胃給予相同體積的生理鹽水。每天給藥1次,連續14 d。

1.6PTSD大鼠模型制備 參照文獻〔7〕,采用SPS方法構建PTSD大鼠模型,具體操作為:先將大鼠置于固定器中束縛2 h,然后強迫游泳20 min,隨后休息15 min,再用乙醚麻醉至意識喪失,待其清醒后放回籠中正常喂養。

1.7Morris水迷宮實驗 水迷宮為直徑150 cm、高60 cm的圓形水池,注水深度為25 cm,直徑為12 cm的平臺置于水面下2 cm。(1)定位航行試驗:在第1～5天,將大鼠面向池壁輕輕放入水中,任其自由游泳,觀察大鼠在水池中的活動軌跡,記錄大鼠找到平臺的所用的時間。如果120 s后大鼠仍沒有找到平臺,用竹竿引導其到達平臺,該大鼠逃避潛伏期計為120 s。最后將每只大鼠5 d的找平臺所用時間平均化得到逃避潛伏期的值。(2)空間探索試驗:在第6天,撤去平臺,將大鼠于相同位置面向池壁放入水中,記錄60 s內大鼠穿越原平臺所在位置的次數,用于檢測大鼠的空間記憶能力。行為學實驗結束后進行后續指標檢測。

1.8免疫熒光實驗 將大鼠用10%水合氯醛麻醉,先用生理鹽水進行心臟灌流至全身發白,然后用4%多聚甲醛灌流。隨后斷頭,取出腦組織并置于4%多聚甲醛中后固定6 h。用冰凍切片機進行冠狀切片,片子厚度為30 μm,經0.3 % TritonX-100通透2 h和10 % BSA 封閉1 h后,加入一抗(NeuN,1∶200;GAP43,1∶500),室溫孵育2 h后,分別加入Cy3標記二抗和Alexa Fluor 488標記二抗,濃度比均為1∶1 000,室溫避光孵育2 h,封片,鏡檢并拍照,利用Image pro plus6.0圖像處理軟件檢測平均積分光密度(OD值)。皮層和海馬神經元胞核內可見Cy3標記的紅色熒光免疫反應陽性產物為NeuN蛋白。皮層和海馬神經元胞膜上可見Alexa Fluor488標記的綠色熒光免疫反應陽性產物為GAP43蛋白。

1.9分光光度計檢測血清SOD、MDA和GSH-PX含量 大鼠尾靜脈取血后,離心,取10 μl血清按照試劑盒說明書進行SOD、MDA和GSH-PX含量的測定。

1.10統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1丹酚酸B對PTSD大鼠空間學習記憶能力的影響 圖1為水迷宮實驗的第3天各組游泳路線,與正常組比較,模型組找到平臺之前的游泳路線明顯延長;與模型組比較,帕羅西汀組和丹酚酸B低、中、高劑量組找到平臺之前的游泳路線明顯縮短。與正常組比較,模型組逃避潛伏期明顯延長,穿越原平臺次數明顯減少(P<0.01);與模型組比較,帕羅西汀組和丹酚酸B低、中、高劑量組逃避潛伏期明顯縮短,穿越原平臺次數明顯增加(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 丹酚酸B對PTSD大鼠空間學習記憶能力的影響

圖1 各組游泳路線(水迷宮實驗)

2.2丹酚酸B對PTSD大鼠皮層和海馬NeuN表達的影響 與正常組比較,模型組皮層和海馬NeuN表達明顯減少(P均<0.01);與模型組比較,帕羅西汀組和丹酚酸B低、中、高劑量組皮層和海馬NeuN表達明顯增多(P均<0.01)。見圖2、表2。

表2 丹酚酸B對PTSD大鼠NeuN和GAP43表達、SOD、MDA和GSH-PX含量的影響

圖2 丹酚酸B對PTSD大鼠皮層和海馬NeuN、GAP43表達的影響(免疫熒光染色,×200)

2.3丹酚酸B對PTSD大鼠皮層和海馬GAP43表達的影響 與正常組比較,模型組皮層和海馬GAP43表達明顯減少(P<0.01);與模型組比較,帕羅西汀組和丹酚酸B低、中、高劑量組皮層和海馬GAP43表達明顯增多(P<0.01)。見圖2、表2。

2.4丹酚酸B對PTSD大鼠血清SOD、MDA和GSH-PX含量的影響 與正常組比較,模型組血清SOD、GSH-PX含量明顯減少,MDA含量明顯增多(P<0.01);與模型組比較,帕羅西汀組和丹酚酸B低、中、高劑量組血清SOD、GSH-PX含量明顯增多,MDA含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

3 討 論

目前PTSD發病機制尚不清楚。但從眾多臨床病例和實驗研究中可以發現,學習記憶功能的減弱是PTSD的主要癥狀。Morris水迷宮是國內外通用的檢測動物學習記憶能力的方法〔8〕,本研究結果說明各組大鼠都有一定的學習記憶能力,提示SPS可以導致大鼠學習記憶損傷,而丹酚酸B可以一定程度地逆轉這種損傷,效果同陽性藥物帕羅西汀。

學習與記憶的形成是一個摻有多種機制的復雜的過程,目前得到普遍認可的是與神經元的缺失、突觸可塑性的改變密切相關。NeuN廣泛分布于神經系統的腦區,如皮層、海馬、小腦等,NeuN表達下降指示神經元丟失,因此NeuN通常被作為神經元的特異性標志物,直接決定突觸傳遞效能可否正常進行〔9〕。GAP43又稱神經調節蛋白,是一種神經特異性的鈣調素結合蛋白質,參與神經生長和神經再生,同時能調節軸突的長度,改變細胞形態等,在突觸可塑性的過程中發揮重要作用〔10〕。GAP-43不僅是突觸生長發育的標志性蛋白,也可以作為反映學習記憶能力的標志性蛋白。本研究結果提示,創傷應激可以使腦組織內NeuN和GAP43表達下調,而丹酚酸B可以逆轉這種下調。當機體尤其是神經系統處于應激狀態時,活性氧(ROS)自由基水平會大幅提高,體內氧化系統與抗氧化系統之間的平衡即會打破,自由基的過度生成會超出抗氧化劑的清除作用而呈現氧化應激狀態。抗氧化酶SOD、GSH-PX是典型的抗氧化物質,脂質過氧化產物MDA是典型的氧化物質。研究證明,氧化應激是促進PTSD發生發展的重要環節。而具有多酚類結構的丹酚酸B是一種很好的自由基清除劑。有文獻報道丹酚酸B通過降低小鼠肝臟中GSH含量使抗氧化系統趨于正常,降低肝損傷程度〔11〕;丹酚酸B還可以通過提高SOD含量、下調MDA和LDH含量,緩解氧化應激反應,對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織起保護作用〔12〕。本實驗結果與上述報道一致。

綜上,丹酚酸B可以改善PTSD大鼠學習記憶能力,具有一定的神經保護作用,其機制可能與改善突觸可塑性,抑制氧化應激反應有關。