基于Nrf2/ARE通路探討尼可地爾對冠脈微循環障礙大鼠的保護作用

陳立強 劉敬 劉蘭博 劉春苗

(1河北醫科大學第四醫院,河北 石家莊 050011;2石家莊市第四醫院)

冠脈微循環障礙是當前常見心臟疾病,隨疾病發展可導致心肌梗死、心功能下降等,改善冠狀動脈微循環障礙成為治療冠心病的主要目標。當冠脈微循環障礙發生后,炎癥反應隨之而來,研究發現核轉錄因子NF-E2相關因子(Nrf)2/抗氧化反應元件(ARE)信號通路與血管氧化應激損傷之間存在密切聯系,而氧化應激損傷是冠心病發生及發展的關鍵因素〔1〕。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白(Keap)1可在生理狀態下與Nrf2發生耦聯,而Nrf2在細胞氧化過程中起到抑制作用,該反應過程中還存在醌氧化還原酶(NQO)1、過氧化氫酶(CAT)及血紅素加氧酶(HO)-1等因子參與,并且可結合ARE序列〔2〕。冠脈微循環障礙發生后可激活Nrf2/ARE信號通路,促進多種抗氧化酶表達,從而發揮抗氧化作用,降低心肌損傷〔3〕。本研究通過檢測冠脈微循環障礙大鼠模型Nrf2/ARE信號通路相關因子表達及心肌損傷情況,探究尼可地爾對于冠脈微循環障礙的改善效果。

1 資料與方法

1.1實驗動物 選取SD大鼠50只,均為SPF級雄性大鼠,由凱學生物科技(上海)有限公司提供,體質量289～312 g,平均(302.45±2.39)g,入組后所有動物進行為期1 w的適應性飼養,溫度18～22 ℃,這期間所有動物自由飲水、進食。

1.2實驗儀器及材料 電子天平(FA1104,上海天平儀器廠產品),切片機(HM340E 型,德國),恒溫水浴箱(上海新苗醫療器械制造有限公司),光學顯微鏡、顯微照相機(OLYMPUS 公司,日本),石蠟包埋機(TKY-BMB,湖北泰康醫療設備有限公司)。止血鉗、剪刀、蘇木素液、伊紅、碘伏、無菌手套等。

1.3動物分組 將50只動物隨機分為對照組、假手術組、模型組、低劑量組、高劑量組,各10只,造模前所有動物進行普通飼養。

1.4制備冠脈微循環障礙大鼠模型 模型制備前所有大鼠禁食12 h,期間自由飲水,無菌環境內進行模型制備,常規麻醉,取大鼠仰臥位固定于手術臺上,連接動物呼吸機,切開胸腔,使用胰島素針刺入左心室,觀察到回血后注射月桂酸鈉,1 ml/kg,確保其進入冠狀動脈,待大鼠心率穩定后縫合。假手術組手術操作與手術組一致,但不進行月桂酸鈉注射,然后進行常規縫合。對照組不進行任何手術干預,術后各組常規飼養,期間不使用抗生素及抗凝劑,對大鼠生存狀態進行密切觀察。

1.5干預方法 將適應性飼養及造模,排除不成功大鼠后的剩余大鼠進行常規飼養,即對照組、假手術組、模型組、低劑量組、高劑量組,各8只,飼養期間溫度保持在18～22 ℃,保持動物房內良好通風。根據體表面積法進行大鼠用藥劑量換算,大鼠給藥劑量=成人每日劑量(g)×大鼠體質量與體表面積比值/人體質量與體表面積比值。大鼠尼可地爾用藥劑量0.784 kg/(mg·d)為高劑量組,0.392 kg/(mg·d)為低劑量組,將尼可地爾溶于生理鹽水,每日灌胃;其他組每日進行同劑量生理鹽水灌胃,每只大鼠的給藥體積2 ml/d,結合大鼠生長情況調整用藥劑量,連續進行28 d干預,1次/d。

1.6超聲心動圖檢測 對大鼠進行全身麻醉,固定于超聲心動圖儀器上,探頭掃描大鼠左胸第3、4肋間,連續測定3個不同心動周期左室收縮末期內徑(LVESD)、左室舒張末期內徑(LVEDD),計算大鼠左室射血分數(LVEF),并邀請專業人員進行盲評,確定大鼠是否造模成功。

1.7血清樣本采集 常規麻醉大鼠,抽取腹主動脈血,離心處理,轉速設置為3 500 r/min,離心時間設置為10 min,分離上層清液低溫存儲備用。

1.8心臟標本 在完成取血后,胸腔做切口,分離心臟并取出,沖洗后將其均分為2部分,分別用于病理觀察及RT-q聚合酶鏈反應(PCR)、Western印跡檢測。

1.9病理學觀察 制備石蠟切片,甲醛固定心肌組織,經脫水透明處理后進行石蠟包埋,制成組織切片,厚度約4 μm。烘烤組織切片,經脫蠟處理后進行染色,蘇木素染色50 s,伊紅染色50 s,經反復處理后制成樹膠封片,鏡下觀察蘇木素-伊紅染色(HE)情況。同樣取組織切片,進行馬休黃-酸性品紅-苯胺藍染色,經脫蠟處理后天青石藍染色3～5 min,Mayer蘇木素染色3～5 min,依次進行馬休黃、酸性品紅、苯胺藍染色,制成樹膠封片后鏡下觀察染色情況。取心肌組織進行透射電鏡觀察,甲醛固定后經磷酸漂洗液漂洗后進行鋨酸固定,再次漂洗后將組織置于冰上,脫水處理后進行環氧樹脂包埋,切片后采用枸櫞酸鉛和醋酸鈾雙重染色,透射電鏡下觀察心肌超微結構變化。

1.10血清樣本測定 采用放射免疫法進行檢測,樣本取提前制備好的血清樣本,對谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)水平進行檢測,操作嚴格按照試劑盒說明進行,且由同組人員完成所有操作。

1.11RT-qPCR檢測 取心肌組織樣本,高壓蒸汽滅菌后于液氮中進行組織研磨,直至組織研磨成粉末狀,使用裂解液對組織粉末進行裂解處理,并對其進行離心處理,溫度設置為4 ℃,時間5 min,轉速12 000 r/min,分離上清,加入等體積異丙醇,充分混勻后孵育30 min,再次離心處理,棄上清,加入配制好的乙醇溶液,再次離心后棄上清,多次處理后室溫下晾干3 min,根據沉淀量加入適量DEPC水,充分混勻后獲得RNA,測定RNA濃度,確定提取RNA純度在1.8～2.0,對1 μg RNA體積進行計算。逆轉錄獲得cDNA,然后進行PCR檢測,測定HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1 mRNA表達情況。

1.12Western印跡檢測 提取總蛋白,取心肌組織,液氮低溫處理后進行組織研磨,移入離心管中加入蛋白裂解液,反應結束后進行離心處理,轉速12 000 r/min,時間為5min,分離上清進行蛋白測定。經蛋白定量、電泳、轉膜后進行免疫反應,依次加入一抗、二抗,反應結束后進行顯色曝光,對目的條帶灰度值進行分析,并根據測定結果計算蛋白的相對表達量,分別測定Nrf2、Keap1、NQO1、CAT、HO-1蛋白表達情況。

1.13統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠心功能改善情況 與對照組相比,模型組LVEDD、LVESD均升高,LVEF降低;與假手術組相比,模型組LVESD升高,LVEF降低;與模型組相比,低劑量組LVEDD、LVESD均降低,LVEF升高,高劑量組LVEDD、LVESD均降低,LVEF明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組超聲心動圖

表1 5組心功能對比

2.2各組心肌組織病理學變化 模型組冠脈微血管內分布有紅色或白色血栓混合物,心肌纖維化明顯;對照組、假手術組無血栓,但存在少量紅細胞,尼可地爾干預后兩組心肌排列明顯改善,纖維化及血栓減輕。馬休黃-酸性品紅-苯胺藍染色顯示模型組栓塞嚴重,空白組、假手術組無血栓,經尼可地爾干預兩組血栓明顯改善。透射電鏡觀察顯示,模型組心肌細胞破裂、閏盤間隙過大,線粒體呈絮狀改變,內部復雜性降低,Z線明顯不平,對照組及假手術組襲擊細胞排列整齊,尼可地爾干預后兩組線粒體損傷緩解,細胞排列整齊,Z線改善。見圖2。

圖2 各組不同染色方法冠脈微血管觀察及心肌細胞、線粒體表現

2.35組血清樣本MDA、SOD、GSH-Px水平 與對照組相比,模型組MDA升高,高劑量組MDA降低,高劑量、低劑量組SOD升高,高劑量組GSH-Px升高;與假手術組相比,模型組MDA升高,高劑量、低劑量組SOD升高,高劑量組GSH-Px升高;與模型組相比,高劑量組MDA降低,高劑量、低劑量組SOD升高,高劑量組GSH-Px升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組MDA、SOD、GSH-Px、HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1 mRNA表達對比

2.45組組織HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1 mRNA表達 與對照組相比,高劑量組HO-1、CAT、Nrf2及NQO1 mRNA水平升高,Keap1降低,低劑量組Nrf2、HO-1升高;與假手術組相比,高劑量組Nrf2、NQO1、CAT、HO-1 mRNA升高,低劑量組HO-1升高;與模型組相比,高劑量組Nrf2、NQO1、CAT、HO-1 mRNA升高,低劑量組HO-1升高,差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

2.55組組織HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1蛋白表達 與對照組相比,高劑量組Nrf2、NQO1、CAT及HO-1蛋白水平升高,Keap1降低,低劑量組HO-1升高,差異均有統計學意義(P<0.05);與假手術組相比,高劑量組Hrf2、NQO1、CAT、HO-1蛋白水平升高,Keap1降低,低劑量組Keap1降低,HO-1蛋白水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,高劑量組Hrf2、NQO1、CAT、HO-1 蛋白水平升高,低劑量組HO-1蛋白水平升高,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖3。

1～5:對照組、假手術組、模型組、低劑量組、高劑量組圖3 各組組織HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1蛋白表達

表3 5組組織HO-1、Keap1、CAT、Nrf2及NQO1蛋白表達對比

3 討 論

據臨床數據統計顯示,冠脈微循環障礙具有較高的發生率,嚴重影響患者原發疾病恢復。關于冠脈微循環障礙形成機制的研究較早,以往研究分析可以發現,多數學者認為氧化應激損傷與冠脈微循環障礙的發生及發展存在密切聯系〔4〕。有研究指出,在冠脈微循環障礙發生患者中,其機體炎癥反應及氧化應激反應明顯高于未發生冠脈微循環障礙患者,氧化應激反應及炎癥反應是導致冠脈微循環障礙發生的關鍵〔5〕。冠脈微循環障礙發生時會損害血管內皮,進而導致血小板及中性粒細胞黏附,引起管腔狹窄或閉塞,致使血管閉塞區域出現循環障礙,加重患者損傷〔6〕。在冠脈微循環障礙形成后,增加氧自由基生成,促進炎性細胞浸潤,激活凋亡信號通路,進一步加重組織損傷的發生。

氧化應激反應過程中伴隨多種氧自由基的產生,氧自由基極易攻擊生物膜磷脂中的不飽和脂肪酸,造成組織損傷。內皮細胞在發生氧化損傷時,細胞膜會伴有脂質過氧化情況,大量酸性物質釋放,破壞細胞質內質網、線粒體等細胞器結構,引起蛋白質變性〔7〕。隨著血管內皮功能不全的發生,降低內皮源性NO生物利用度,增強血管壁炎性反應,促進多種促凝物質及黏附分子分泌,最終形成血栓〔8〕。已有研究證實,Nrf2屬于對抗氧化應激的細胞保護機制,通過調節抗氧化基因轉錄完成的,在誘導內源性抗氧化酶中起關鍵作用〔9〕。有研究指出,Nrf2可能會成為抗炎、改善血管內皮及解毒等防御機制的治療靶點〔10〕。在正常細胞中,Nrf2呈低水平狀態,表達于細胞質中,主要受Keap1調控。但是當機體受到有毒物質侵害時,細胞內(ROS)水平升高,影響Keap1結構,分離Keap1和Nrf2〔11〕。本研究可以看出,尼可地爾可有效糾正冠脈微循環障礙大鼠氧化應激狀態,調節與Nrf2/ARE信號通路相關的因子表達,從而達到促進血管恢復的目的。

Nrf2/ARE 信號通路是Nrf2在進入細胞核后結合抗氧化反應元件(ARE)形成的,從而促進下游一系列反應的發生,這些物質均可起到機體保護作用,其中主要有HO-1、CAT、NQO1等因子參與〔12〕。有研究指出,激活Nrf2可以起到心肌保護作用,該保護作用在敲除Nrf2基因大鼠中消失〔13〕。發生冠脈循環障礙后,可產生大量ROS,進而斷開Keap1與Nrf2之間的耦聯,致使Nrf2進入到細胞核內,對下游抗氧化酶激活起到促進作用〔14〕。關于Nrf2/ARE信號通路在冠脈微循環障礙中作用機制的研究相對較少,該信號通路與氧化應激損傷有關,而冠脈微循環障礙形成與氧化應激密不可分〔15〕。本研究也可以看出,在冠脈微循環障礙發生過程中,HO-1、CAT、NQO1等因子水平發生一定變化,且在經尼可地爾干預后,可進一步激活Nrf2/ARE 信號通路,促進HO-1、CAT、NQO1等因子的釋放,從而起到抗氧化應激的細胞保護作用,緩解血栓導致的血管內皮損傷。尼可地爾屬于臨床常用藥,多用來治療冠心病、心絞痛等疾病,在冠脈微循環障礙治療中比較常見。尼可地爾屬于鉀通道激活劑,可以起到舒張動脈血管的作用,關于尼可地爾治療冠脈微循環障礙的研究相對較少,臨床資料不足。本研究證實,尼可地爾可有效起到疏通血管效果,促進血管內壁恢復,且機制可能與Nrf2/ARE 信號通路有關。