左炔諾孕酮聯合miRNA-21-5p抑制劑對子宮內膜癌細胞增殖、轉移的作用及機制

馬鴻云 田春花 馬釗 吳陽 桂甜甜

(寧夏回族自治區人民醫院 寧夏眼科醫院,寧夏 銀川 750002)

子宮內膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤,也是全球女性中第四常見的惡性腫瘤〔1〕。據Evans等〔2〕報道,英國子宮內膜癌的發病率正不斷上升。而中國癌癥登記處提供的數據顯示,中國也觀察到類似趨勢〔3〕。盡管子宮內膜癌在診斷和治療方面(包括手術、化療和放療)取得相當大的進展〔4〕,但轉移性子宮內膜癌的預后仍較差〔5,6〕。因此,有必要尋找新的臨床適用的分子靶點和更有效的子宮內膜癌治療策略。

微小核糖核酸(miRNAs)被發現具有促癌作用〔7〕,并與包括子宮內膜癌在內的許多癌癥的進展密切相關〔8〕,多種miRNA已被認為是子宮內膜癌診斷和預后的生物標志物〔9〕。miR-21-5p在多種腫瘤中高表達〔10〕,研究證實,多發性腫瘤抑制基因磷酸酶基因(PTEN)、原肌球蛋白基因(TPM)1、程序性細胞死亡基因(PDCD)4 mRNA的3'非編碼區(UTR)均含有miR-21-5p特異性識別和結合位點〔11〕。此外miR-21-5p在前列腺癌中的異常表達還可以促進前列腺癌細胞多藥耐藥〔12〕。然而,miR-21-5p在子宮內膜癌診斷和治療中的潛在作用研究尚不多。左炔諾孕酮(LNG)是第二代合成孕激素,是諾孕酮外消旋混合物的生物活性異構體,目前主要作為一線口服緊急避孕藥或作為與雌激素聯合使用的長期避孕藥物〔13〕。研究指出,LNG可以作為子宮內膜癌的初級保守治療方式,盡管其療效尚未得到證實,但已有研究指出LNG聯合口服孕激素具有較強的抑制子宮內膜癌的作用〔14〕。但LNG對子宮內膜癌的作用機制尚不明確。本研究首次提出LNG與miR-21-5p抑制劑(inhibitor)聯合使用抑制子宮內膜癌細胞增殖、轉移的方案,為后續臨床治療子宮內膜癌提供新的方法和理論支持。

1 材料與方法

1.1臨床樣本采集 臨床腫瘤標本采自2018年9月至2019年7月在寧夏回族自治區人民醫院治療的子宮內膜癌患者組織10例(均經病理檢查確診),組織標本離體后30 min內置于液氮罐內迅速冷凍保存。

1.2實驗細胞 人子宮內膜癌細胞系Ishikawa購自北納生物(BNCC338359)。

1.3試劑與儀器 LNG購自Selleckchem公司;Lipofectamine3000購自Invitrogen公司;miR-21 inhibitor和miR-21無關序列(NC)合成于安徽通用公司;Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自聯科生物;RNA提取試劑盒及逆轉錄試劑盒購自康為世紀公司;PTEN一抗購自abcam(ab170941);結晶紫染色液購自Solarbio;NovoCyteTM流式細胞儀購自艾森生物(杭州)有限公司;多功能酶標儀超高靈敏度化學發光成像系統購自TECAN公司;熒光聚合酶鏈反應(PCR)儀及超高靈敏度化學發光成像系統購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;蛋白電泳儀購自北京市六一儀器廠。

1.4免疫組化 烤片,脫蠟,水化,抗原修復,封閉,敷一抗,稀釋好的一抗:PTEN(1∶100),4 ℃孵育過夜,敷二抗,滴加辣根酶標記山羊抗兔IgG(1∶100),37 ℃孵育30 min,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木素復染,脫水、透明、封片、鏡檢。

1.5細胞分組處理 將Ishikawa細胞分為4組,對照(Control)組、LNG處理(LNG)組、LNG處理+miR-21 NC(LNG+miR-21 NC)組和LNG處理+miR-21 inhibitor(LNG+miR-21 inhibitor)組。

1.6細胞轉染 Ishikawa細胞鋪6孔板,加入5 μl lipofectamine3000,混勻后室溫孵育15 min,將細胞放回孵箱培養,轉染6 h后在6孔板中加入20%血清完全培養基1 ml,48 h后進行檢測。

1.7實時熒光定量(qRT)-PCR 熒光PCR儀進行熒光定量PCR。反應體系如下:RNase Free dH2O 9.5 μl、cDNA 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μl。miRNA反應體系如下:RNase Free dH2O 7.2 μl、cDNA 2 μl、上游引物0.4 μl、下游引物10.4 μl、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl。反應步驟如下:預變性 95 ℃,10 min;變性95 ℃,10 s;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,30 s;40個循環。引物序列由通用生物系統(安徽)有限公司設計合成,引物序列:PTEN正義:TTTTGAAGACCATAACCCACC,反義:TCATTACACCAGTTCGTCCCT;miR-21-5p正義:TAGCTTATCAGACTGATGTTGA,反義:CTACAATAAACGCGACCACG;GAPDH正義:TGACTTCAACAGCGACACCCA,反義:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA;U6正義:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT,反義:CGC-TTCACGAATTTGCGTGTCAT。

1.8CCK8檢測細胞增殖 Ishikawa細胞中每孔加入10 μl CCK8檢測試劑,37 ℃孵育2 h,酶標儀在450 nm波長處檢測細胞吸光值并計算存活率。細胞存活率=(實驗組細胞OD/對照組細胞OD)×100%〔10〕。

1.9流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞106個,用結合緩沖液重懸細胞,利用Annexin Ⅴ-FITC/PI Apoptosis Kit試劑盒,上NovoCyteTM流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.10細胞劃線檢測細胞遷移 Ishikawa細胞鋪6孔板待密度達到90%以上后進行劃線,0 h后給每孔的細胞劃痕拍照,24 h后再次給每孔的劃痕拍照,進而計算出細胞的遷移速率。遷移速率=遷移距離/遷移時間〔11〕。

1.11Transwell檢測細胞侵襲 各組細胞消化收集,離心,計數,每個小室接種細胞5×104個,24 h后去除孔中培養基,結晶紫靜置染色1 h,拍照計數。

1.12Western印跡檢測 各組細胞加入細胞裂解液,提取總蛋白。根據二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),用300 mA恒流轉膜80 min。一抗溶液孵育,4 ℃過夜,二抗溶液中室溫孵育2 h。在凝膠成像系統中曝光。用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.13統計學分析 采用Graphpad Prism7軟件,組間顯著性差異采用one-way ANOVA分析。

2 結 果

2.1子宮內膜癌組織PTEN表達 與治療前(0.160±0.050)相比,LNG治療后子宮內膜PTEN表達水平(0.377±0.024)明顯升高(P=0.000),見圖1。

圖1 子宮內膜癌組織中PTEN表達(DAB,×200)

2.2LNG作用濃度與時間選擇 與0 μmol/L相比,24、48 h時50、100 μmol/L LNG使細胞活力均明顯下降,細胞凋亡率均明顯升高且1、5、10 μmol/L LNG 24 h凋亡率亦明顯升高(P<0.01)。其中100 μmol/L效果更加明顯,因此選擇100 μmol/L LNG、24 h進行后續實驗。見表1、圖2。

表1 LNG作用濃度對不同時間點細胞活力、凋亡的影響

圖2 流式檢測LNG不同濃度與作用時間的凋亡率

2.3miR-21-5p驗證結果 采用qPCR方法驗證miR-21-5p inhibitor的轉染效果,與Control組(1.000±0.00)和miR-21 NC組(0.809±0.121)相比,miR-21 inhibitor組細胞中miR-21-5p相對表達量(0.754±0.130)明顯下降(P=0.026)。

2.4LNG聯合miR-21 inhibitor處理后細胞增殖變化 與Control組(100.000±4.161)相比,LNG組細胞增殖活性(79.712±3.734)明顯下降;與LNG組相比,LNG+miR-21 inhibitor組細胞增殖活性(55.515±1.655)明顯下降(均P<0.01)。

2.5LNG聯合miR-21 inhibitor后細胞凋亡變化 與Control組〔(9.803±0.241)%〕相比,LNG組細胞凋亡率〔(18.323±0.318)%〕明顯上升;與LNG組相比,LNG+miR-21 inhibitor組凋亡率〔(27.297±0.523)%〕明顯上升(均P<0.01)。見圖3。

圖3 LNG聯合miR-21 inhibitor后各組細胞凋亡

2.6LNG聯合miR-21 inhibitor后細胞遷移能力變化 與Control組(4.930±1.672)相比,LNG組細胞遷移細胞數〔(2.640±1.028)個〕明顯下降;與LNG組相比,LNG+miR-21 inhibitor組細胞遷移細胞數〔(1.043±0.416)個〕明顯下降(均P<0.001)。見圖4。

圖4 LNG聯合miR-21 inhibitor后各組細胞遷移(熒光定量染色,×100)

2.7LNG聯合miR-21 inhibitor后細胞侵襲能力變化 與Control組(3.819±0.697)相比,LNG組細胞侵襲細胞數〔(2.392±0.234)個〕明顯下降(P=0.000);與LNG組(1.206±0.210)相比,LNG+miR-21 inhibitor組細胞侵襲細胞數〔(0.801±0.124)個〕明顯下降(P<0.01)。見圖5。

圖5 各組細胞侵襲能力(結晶紫染色,×100)

2.8各組細胞中miR-21-5p、PTEN、磷脂酰肌醇-3(PI3K)、p-PI3K、AKT和p-絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)表達 與Control相比,其他3組miR-21-5p表達明顯下調;與LNG相比,LNG+miR-21 inhibitor組miR-21-5p表達明顯下降(P<0.01)。與Control相比,其他3組p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K表達明顯下降,PTEN表達明顯升高;與LNG組相比,LNG+miR-21 inhibitor組p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K比值明顯下降,PTEN表達明顯升高(均P<0.01)。見表2、圖6。

表2 各組細胞中miR-21-5p、PTEN、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT表達

1～4:Control組、LNG組、LNG+miR-21 NC組、LNG+miR-21 inhibitors組圖6 各組細胞PTEN、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT表達

3 討 論

PTEN是PI3K/AKT通路的上游信號分子,是一種與腫瘤細胞生長、增殖、黏附等惡性生物學相關的抑癌基因〔12,13〕。在婦科惡性腫瘤中,PTEN與子宮內膜癌關系密切,PTEN的缺失會削弱其對腫瘤細胞生長的調控作用〔14〕。已有研究指出,PTEN通過調節PI3K/AKT信號轉導通路,調節細胞生長,抑制腫瘤〔15〕。因此PTEN作為一種新的抑癌基因,其獨特的作用方式可以為腫瘤的基因治療和新開發的抗腫瘤藥物提供新的靶點。本研究結果支持LNG聯合miR-21-5p inhibitor治療對子宮內膜癌等相關癌癥的治療作用的理論研究,為子宮內膜癌提供了新的治療策略。

miRNA以互補配對的方式與靶基因3'UTR區結合,降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA的翻譯,從而影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉移,已有研究表明PTEN是miR-21-5p特異性識別和結合位點〔16〕。目前,miRNA inhibitor被認為是治療某些癌癥的有前途的治療方法,但進入臨床應用的miRNA療法數量卻很少,這是因為開發miRNA有效的傳遞系統時遇到障礙〔17〕。而采用miRNA和其他藥物的聯合使用可能是一種直觀的解決策略〔18〕,但miRNA聯合治療的候選藥物尚在研究中,它們的協同抑制作用也需要探索。本研究成功構建miR-21-5p inhibitor并證實可以有效抑制miR-21-5p 的表達促進PTEN表達,這為后續聯合治療提供了基礎。

子宮內膜癌是由激素引起的,激素治療相對毒性低于目前的化療和放療等治療方式〔19〕。孕酮的幾種衍生物已被用于治療晚期和復發性子宮內膜癌,或希望保持生育能力的患者〔20〕。LNG是目前臨床上已開始用于治療子宮內膜癌的激素,但患者的總有效率和治療效果差異很大〔21〕。 因此有必要尋找聯合或更有效的方式來治療子宮內膜癌。

本研究發現LNG聯合miR-21-5p inhibitor可以更加有效抑制子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和轉移,此過程主要是通過上調PTEN表達進而抑制PI3K/AKT通路活性。綜合治療方法是一種很有前景的子宮內膜癌治療方法。雖然已經在體外證明了LNG聯合miR-21-5p inhibitor的協同作用,但更多的數據仍需進行體內實驗來進行驗證。