腺病毒介導的RNAi對VaD大鼠腦內NgR/RhoA/ROCK2信號通路的影響

鄧秋媚 向軍軍 吳林 莫雪妮 陳煒 黎軍宏 胡躍強

(1廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530200;2廣西中醫藥大學第一附屬醫院)

血管性癡呆(VaD)的發病機制尚不完全清楚,目前認為腦血管病變是導致VaD認知障礙的主要環節〔1〕。突觸可塑性是認知功能的神經生物學基礎,在神經損傷修復及學習和記憶中起著重要的作用〔2〕。研究證實,Nogo受體(NgR)能和3種主要髓鞘抑制蛋白:髓磷脂相關抑制物(Nogo-A)、髓鞘相關糖蛋白(MAG)、少突膠質細胞髓鞘糖蛋白(OMgp)結合,進而促進其下游Ras基因家族成員(Rho)A/Rho相關激酶(ROCK)信號途徑,抑制軸突再生〔3〕,成為影響神經元生長的重要因素,是防治VaD發病及治療干預的關鍵調控蛋白。本研究采用腺相關病毒(AAV)基因干擾技術表達短發夾架構RNA(shRNA)抑制NgR/RhoA/ROCK2信號通路,觀察其對VaD大鼠的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物與分組 健康雄性SPF級SD大鼠40只,3月齡,體質量(250±50)g,由湖南斯萊克景達物實驗動物有限公司提供,動物許可證號:SCXK湘2019-0004。適應性飼養1 w后按隨機數字表法分成4組:假手術組、模型組、NgR干擾組(腺相關病毒)、陰性對照組(NgR空載體病毒),每組各10只。

1.2藥物制備及主要儀器試劑 ①實驗藥物:AAV9-NgR-shRNA注射液及空載體病毒(上海吉滿生物科技有限公司制造)。②主要儀器及試劑:引物及內參(天根生物科技有限公司);二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、β-actin抗體(碧云天生物公司);兔抗NgR多克隆抗體、兔抗RhoA多克隆抗體、兔抗ROCK2單克隆抗體均購自美國Abcam公司;MT-200型Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司);HM355S型全自動石蠟切片機(德國MICROM);聚合酶鏈反應(PCR)儀(ABI公司,型號7500);水平電泳儀(北京六一儀器廠,型號DYCP-31DN);半干轉膜儀系統(ATTO公司,型號WSE-4040)。

1.3實驗模型制備及藥物干預 參照文獻制備VaD大鼠模型〔4〕,評估模型成功后,將AAV-NgR-shRNA原液稀釋至3.26×1012vg/ml,采用腦立體定位儀將其注入海馬組織,每只動物注射總量4 μl,持續5 min;陰性對照組注射等量空載體病毒。術后各組正常喂養,觀察4 w。

1.4指標觀察

1.4.1學習記憶能力測定 ①定位航行實驗:術后第1周、第4周,每組大鼠每天上下午從4個象項各訓練一次,將大鼠尋找平臺的時間設置為120 s,記錄大鼠從入水到爬上平臺所需時間,即逃避潛伏期,作為大鼠空間學習能力的檢測指標。②空間搜索實驗:大鼠完成定位航行實驗后,于術后第1周、4周進行空間探索實驗,撤走平臺,依次將大鼠從4個象限放入水中,分別記錄其跨越原來平臺的次數,作為空間記憶的檢測指標。

1.4.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測NgR、RhoA、ROCK2 mRNA表達 海馬組織總RNA運用Trizol法提取,提取完成后取2 μg RNA開始逆轉錄,引物由天根生物科技有限公司設計并提供。引物序列:β-actin上游引物:5′-GCGCAAGTACTCTGTGTGG-3′,下游:5′-AGGGTGTAAAACGCAGCTCAG-3′;NgR上游引物:5′-AATGCACTCAAGGGAC-GTGT-3′,下游:5′-CTACGGGTGCGGTTCTTTCT-3′;RhoA上游引物:5′-AGGATTGGCGCTTTTGGGTA-3′,下游:5′-TTC-ACAAGATGAGGCACCCC-3′;ROCK2上游引物:5′-ACAA-ACCAAGCTAACTGCCT-3′,下游:5′-CTACGGGTGCGGTTCTTTCT-3′。逆轉錄后擴增條件如下:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共40個循環,最后完成72 ℃總延伸5 min,每組各取5 μl PCR產物電泳,凝膠成像儀獲取圖像,以2-ΔΔCt法對樣本基因進行表達差異相對定量分析。

1.4.3Western印跡檢測NgR、RhoA、ROCK2蛋白表達水平 按說明書提取各組海馬組織蛋白,用BCA試劑盒測定并調整每個樣本蛋白濃度之后上樣。連接電泳裝置及電源,電壓設為120 V恒壓,1.5 h后停止電泳,用封閉液〔含5%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)溶液〕室溫封閉膜2 h,用新配制的封閉液稀釋抗體 4 ℃孵育過夜。用封閉液稀釋各蛋白一抗對應的二抗,室溫下孵育膜1 h,用PBST洗膜用于圖像采集。加電化學發光(ECL)工作液,在凝膠成像儀下曝光成像,采用凝膠成像分析系統進行圖像分析,獲取各組Western印跡條帶的平均光密度(OD)值,內參為β-actin,目的蛋白與內參光密度比值即為目的蛋白的相對值。

1.4.4透射電鏡觀察海馬病理變化 大鼠經10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,迅速取出腦組織,取2 mm×2 mm×2 mm大小的右側海馬CA1區組織1塊,置于2.5%戊二醛預固定然后入1%鋨酸繼續固定,經70%、80%、95%乙醇、無水丙酮脫水,環氧樹脂Epon812浸透和包埋,全自動石蠟切片機超薄切片,厚度約4 μm,3% 醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,透射電子顯微鏡觀察海馬組織的結構變化。

1.5統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析,組間比較方差齊者用LSD檢驗,方差不齊者用TamhaneT2檢驗。

2 結 果

2.1各組行為學檢測 術前各組潛伏期及跨越平臺次數比較,差異無統計學意義(P>0.05);術后1 w,模型組、陰性對照組與NgR干擾組潛伏期與跨越平臺次數比較差異無統計學意義(P>0.05),與假手術組比較有顯著性差異(P<0.01,P<0.05);術后4 w,與假手術組比較,模型組與陰性對照組潛伏期及跨越平臺次數差異顯著(P<0.01,P<0.05),與模型組及陰性對照組比較,NgR干擾組潛伏期顯著縮短、跨越平臺次數顯著增加(P<0.05),陰性對照組潛伏期與跨越平臺次數較模型組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組Morris水迷宮行為學檢測比較

2.2各組NgR/RhoA/ROCK2通路相關基因mRNA表達變化 與假手術組比較,模型組及陰性對照組NgR、RhoA、ROCK2 mRNA表達量明顯升高(P<0.01);與模型組及陰性對照組比較,NgR干擾組以上指標顯著下降(均P<0.05),模型組與陰性對照組上述指標無明顯變化(均P>0.05)。見表2。

表2 各組NgR、RhoA、ROCK2 mRNA及蛋白表達

2.3各組NgR/RhoA/ROCK2通路相關蛋白的表達變化 與假手術組比較,模型組及陰性對照組NgR、RhoA、ROCK2蛋白表達水平明顯升高(P<0.01);與模型組及陰性對照組比較,NgR干擾組上述指標顯著下降(P<0.05),模型組與陰性對照組上述指標蛋白表達量無明顯變化(P>0.05)。見表2、圖1。

圖1 Western印跡檢測各組海馬組織NgR、RhoA、ROCK2蛋白表達

2.4電鏡觀察大鼠海馬區超微結構變化 假手術組突觸結構正常且清晰,突觸前膜有大量球形突觸小泡,可見清晰的線粒體,突觸間隙寬度及形態正常,突觸后膜厚度正常且均勻;模型組與陰性對照組突觸形態結構不完整,細胞器結構不清晰,突觸小泡分布零散且形態模糊;NgR干擾組突觸結構清晰,前膜和后膜形態正常,可見清晰的線粒體結構,突觸間隙寬度正常。見圖2。

圖2 各組海馬電鏡下超微結構比較(×10 000)

3 討 論

VaD的病因涉及神經元、軸突和突觸部位的某些神經遞質、受體、蛋白激酶等多種物質的變化〔5〕。研究證實,抑制Rho/ROCK2傳導通路,可減少神經元損傷,促進缺損神經功能的恢復,已成為治療中樞神經損傷藥物研發的新靶點〔6,7〕。NogoA作為重要的軸突抑制因子,與其受體NgR結合后激活RhoA/ROCK信號通路傳遞,影響肌動-肌球蛋白系統,導致生長錐塌陷,從而抑制中樞神經軸突再生〔8〕。正常情況下中樞神經系統內NogoA的表達量較少,當中樞受損后,NogoA/NgR 的表達上調,而其主要作用是抑制損傷后神經重塑和修復〔9,10〕。大量研究證明,使用抗NogoA抗體〔11〕或阻斷NgR表達〔12〕,都可抑制Rho/ROCK2信號通路傳導,促進神經元軸突再生和功能恢復。

已知Nogo是一個堿性磷酸酶融合蛋白,它和軸突表面蛋白結合后,通過跨膜的協同受體形成受體復合物,將抑制性信號傳導至細胞內,從而抑制軸突的再生〔13〕。因此它是整個抑制環節的中樞,將其阻斷有可能促進中樞神經損傷后軸突的再生。有研究采用抑制劑肽(PN1-40)及NgR(310)Ecto-Fc方法治療大鼠脊髓橫斷損傷和缺血性腦損傷后,能夠明顯改善軸突再生,恢復受損的運動功能〔14,15〕。然而,這些拮抗劑的治療效果很大程度上依賴于其傳遞途徑,而且需要長期的給藥,難以達到穩定的血藥濃度。如果能從基因水平抑制NgR的表達水平,將可能取得更佳的效果。在哺乳動物細胞中用siRNA能高效阻斷某個特定基因的表達,特別用于阻斷某些突變基因的表達,或由蛋白表達過量引起的疾病。使用腺相關病毒載體表達短發夾架構RNA(shRNA)能夠長效敲低基因,具有特異、高效等優點,且通過血腦屏障效率高,正成為基因敲低實驗的第一選擇,近年來逐漸成為神經系統疾病研究的新熱點〔16〕。

綜上,腺病毒介導 RNAi 可以明顯降低VaD大鼠海馬NgR表達水平,并可能通過抑制Rho/ROCK信號通路的傳導,促進中樞神經系統軸突的生長及神經元的修復,從而改善認知功能,其機制值得進一步探索。