心力衰竭犬腎交感神經消融術后降鈣素基因相關肽的變化

羅儀山　陳璐珊　潘藝朝　李韶南　劉震　陳平安

【摘要】? 目的? ? 探討腎交感神經消融術（RDN）后不同時間腎動脈降鈣素基因相關肽（CGRP）的表達情況。方法? ? 采用腹主動脈結扎方法制備犬慢性心力衰竭模型，并行RDN。觀察RDN術后不同時間心力衰竭犬血漿及腎動脈CGRP的表達情況。結果? ? 實時熒光定量聚合酶鏈反應（QT-PCR）顯示，與心力衰竭組（HF組）相比，RDN術后3.5個月CGRP表達水平明顯降低（P<0.05），RDN術后9個月CGRP表達量高于術后3.5個月但低于心力衰竭（HF）組（P<0.05）。免疫組織化學染色顯示RDN術后3.5個月組光密度值低于HF組和RDN術后9個月（P<0.05）。結論? ? RDN術后隨著時間的推移腎動脈中存在CGRP表達水平上調，腎交感神經可能存在一定程度恢復。

【關鍵詞】? 心力衰竭； 動物模型； 犬； 交感神經消融術； 降鈣素基因相關肽

Variation of calcitonin gene related peptide in dogs with heart failure after renal devervationLuo Yishan，Chen Lushan，Pan Yichao，Li Shaonan，Liu Zhen，Chen Ping'an*. The First People's Hospital of Guangzhou， Guangzhou，Guangdong? ? 510180

【Abstract】? Objective? To investigate the expression of calcitonin gene related peptide in the different periods after renal devervation in dogs with heart failure. Methods? ? After induced by abdominal aortaconstriction，the dogs were divided into three groups according to whether they underwent renal devervation or the period after renal devervation. Relativegene or protein expression of calcitonin gene related peptide（CGRP）in the renal artery tissues was analyzed by quantitative real time polymerase chain reaction or Western-blot respectively. Plasma levels of CGRP were also detected. Results? ? Compared with the heart failure group， the expression of CGRP in the RDN 1 group（3.5 months after RDN）was significantly decreased（P<0.05）. The expression of CGRP in the RDN 2 group（9 months after RDN）was higher than that in the RDN 1 group， but still lower than in the heart failure group（P<0.05）.Semi-quantitative analysis of immunohistochemistry staining， indicated asthe values of the average optical density（AOD）measured by Image Pro Plus 6.0， showed that values of AOD was lower in the RDN 1 group than in the RDN 2 and heart failure groups（P<0.05）. Conclusion? ? The expression of CGRP in the renal artery increased with the extent of time after RDN.

【Key Words】? Heart failure； Animal model； Dogs； RDN； Calcitonin gene related peptide

中圖分類號：R544.1? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1672-1721（2023）25-0008-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.25.003

腎交感神經消融術（renal devervation，RDN）通過阻斷腎動脈周圍交感神經可起到降低全身交感神經活性的作用。有研究顯示，RDN對難治性高血壓、心力衰竭等交感神經活性增加性疾病具有一定的療效[1-3]。然而也有研究顯示RDN的降壓療效不確切[4]，推測可能與術者經驗，術中消融次數、部位及其釋放的能量，特定的亞組人群不同等諸多因素有關。資料顯示腎交感神經損傷后可能存在再生[5]，若RDN后存在腎交感神經再生，勢必會影響到RDN的療效。本研究從動物實驗的角度探討RDN后不同時間腎動脈降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）的表達情況，通過神經相關肽的變化了解RDN術后腎動脈神經的變化。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 實驗動物和分組? ? 成年健康雜種雄性犬（普通級）14只，體質量12.42～13.01 kg，平均體質量（12.57±1.70）kg，購自廣州龍歸興科動物養殖場。采用腹主動脈結扎方法建立犬慢性心力衰竭（HF）模型后（造模術中及術后共死亡2只）行RDN（術中及術后共死亡3只）。術后分為3組：HF組3只，RDN 1組3只（RDN術后3.5個月），RDN 2組3只（RDN術后9個月）。

1.2? ? 動物心力衰竭模型的制備? ? 采用腹主動脈結扎方法制備犬慢性心力衰竭模型。3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉成功后在雙腎動脈分叉處上段游離腹主動脈，用軟管環繞此處腹主動脈一周測出血管周徑，用手術縫合線雙線結扎腹主動脈，使其周徑減少約50%，結扎后手指尖觸及結扎處下方腹主動脈壁有血流增速感和沖擊感。術后標準飼料喂養[6]。

1.3? ? RDN? ? 經犬股動脈插入8F指引導管行腎

動脈造影明確腎動脈位置后經股動脈植入消融導管（Biosense Webster Ltd，Israel），腹部放置消融電極片并連接射頻消融儀（SmartAblate，Germany），消融溫度為45 ℃，功率為4 W。分別對左右兩側腎動脈采用螺旋式消融6個不同位點，每個位點持續1～2 min。HF組行股動脈穿刺并送入造影導管行雙側腎動脈造影后再送入消融導管，不行腎動脈消融術[6]。

1.4? ? 蛋白質印跡法（Western-blot）法測定腎動脈中CGRP蛋白表達? ? 將腎動脈組織裂解后測定蛋白濃度，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜，先后加入第一抗體（上海江萊生物）、第二抗體孵育，化學發光法顯色，采用β-actin作為內參，Image J軟件進行定量分析。

1.5? ? 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polywerase chain reaction，QT-PCR）檢測腎動脈CGRP的表達? ? 采用Trizol試劑提純腎動脈組織總RNA，并檢測RNA含量和純度，反轉錄成互補脫氧核糖核酸（complernentary DNA，cDNA）。按文獻方法設計CGRP引物序列，CGRP的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）相對表達的定量結果依據2-ΔΔCt法計算。

1.6? ? 免疫組織化學染色? ? 取1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm新鮮腎動脈組織塊放入10%甲醛溶液中固定，制成石蠟切片，進行CGRP免疫組織化學染色。

1.7? ? 酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immuno- sorbent assay，ELISA）血漿CGRP含量? ? 取標本前采取3組動物股靜脈血液2 mL，3 000 r/min離心10 min后分離出血漿-80 ℃低溫保存，按照試劑盒說明書采用ELISA法檢測血漿CGRP含量（上海江萊生物）。

1.8? ? 統計學方法? ? 使用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，正態分布計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2? ? 結果

2.1? ? 一般情況及RDN? ? 腹主動脈結扎后，犬出現不同程度倦怠、消瘦等情況。后進行RDN，RDN術中及術后共死亡3只HF模型犬，可能與消融溫度過高或消融時間過長有關。造影導管行犬腎動脈造影如圖1所示，消融導管行犬RDN術如圖2所示。

2.2? ? Western-blot法測定腎動脈中CGRP蛋白表達水平? ? RDN 2組CGRP蛋白表達較RDN 1組增高，見圖3。

2.3? ? QT-PCR檢測腎動脈CGRP-mRNA表達? ? 與HF組相比，RDN 1組、RDN 2組的CGRP-mRNA表達水平均明顯降低（P<0.05），但RDN 2組表達水平高于RDN 1組（P<0.05），見表1。

2.4? ? CGRP陽性染色細胞吸光度（A）值比較? ? 將3組實驗動物的腎動脈標本制成石蠟切片后行免疫組織化學，利用Image Pro Plus 6.0軟件計算陽性染色細胞的A值并作單因素分析。HF組、RDN 2組的A值均大于RDN 1組（P<0.05），但HF組和RDN 2組比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.5? ? ELISA檢測血漿CGRP含量? ? 3組中HF組血漿CGRP含量最高，RDN 1組其次，RDN 2組血漿CGRP含量最低，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

3? ? 討論

交感神經在心力衰竭的發生、發展過程中發揮著重要作用。腎交感神經的激活對心力衰竭可產生不利影響[7]，因此，采用RDN降低腎臟交感神經活性，對慢性心力衰竭、高血壓等交感神經活性增加性疾病有利。

RDN主要通過降低腎交感神經活性起到影響全身交感神經活性的作用，故RDN后腎交感神經乃至全身交感神經活性降低程度是影響RDN療效的重要因素。然而有資料顯示腎交感神經損傷后可能存在再生，MULDER J等[5]研究表明采用外科手術切除腎交感神經后12周，能觀察到腎交感神經的再生。GAZDAR A F等[8]在腎移植患者的腎組織中也觀察到神經再生，BOOTH L C等[9]對羊行RDN，術后也觀察到羊腎動脈出現了交感神經再支配現象。RDN后腎交感神經的再生勢必會影響到RDN的去神經療效。

相對于外科手術切除腎交感神經，RDN只是對局部腎交感神經起損傷作用，目前尚不知心力衰竭時RDN術后是否存在腎交感神經再生現象。本研究通過動物實驗的方法觀察了RDN術后不同時間反映神經分布情況或再生的相關肽類CGRP的表達量的變化情況，QT-PCR和Western-blot結果顯示，RDN 2組腎動脈CGRP的表達量比RDN 1組增加；免疫組化結果也顯示RDN 2組CGRP陽性染色細胞A值高于RDN 1組，低于HF組（P<0.05）。這表明隨著RDN時間的延長反映神經再生的CGRP表達出現增加，提示RDN后隨著時間的推移腎交感神經可能存在再生。CGRP是一種廣泛分布于神經組織的肽類，具有促進神經細胞生長的作用，CGRP水平高低可間接反映神經的生長情況。有研究顯示CGRP能夠作用于雪旺細胞促進周圍神經再生[10]。故心力衰竭時RDN術后CGRP表達增加可能有利于腎動脈周圍神經的再生。本研究中RDN 2組血漿CGRP含量低于RDN1組，與Western-blot、適時定量PCR及病理結果有一定差異，這可能與血漿CGRP含量影響因素較多，一些心腦血管疾病對血漿CGRP含量有影響有關[11-12]，也可能與本研究樣本量小有關，需大樣本研究進一步證實。

綜上所述，對心力衰竭犬行RDN術后隨著時間的推移腎動脈中反應神經再生的相關肽類物質CGRP表達水平出現上調，提示RDN術后可能存在腎交感神經數量的部分恢復并影響其療效，這為今后優化RDN的心力衰竭療效提供了相關實驗資料。

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（收稿日期：2023-06-07）