厭氧氨氧化細菌梯烷脂的研究進展

王乙橙,晏 鵬,陳猷鵬

厭氧氨氧化細菌梯烷脂的研究進展

王乙橙,晏 鵬,陳猷鵬*

(重慶大學環境與生態學院,重慶 400045)

厭氧氨氧化細菌(AnAOB)在地球氮循環和環境污染治理中扮演著重要角色.AnAOB含有獨特的梯烷脂,其核心結構是3或5個線性串聯的環丁烷基團.至今尚未發現梯烷脂存在于其他細菌中,而且其生物合成通路和生理功能仍然未知.本文對AnAOB梯烷脂的發現、結構、性質、種類、合成及其應用進行了系統綜述,并對梯烷脂的前沿問題和未來研究方向進行了討論與展望.

厭氧氨氧化細菌；磷脂；梯烷脂；環丁烷；生物合成；生物標記物

厭氧氨氧化細菌(AnAOB)是屬于浮霉菌門(Planctomycetes)的一類獨特細菌,能夠進行厭氧氨氧化(Anammox)并產生氮氣,從中獲取能量生長繁殖[1-4].AnAOB是介導地球氮循環的重要微生物類群[2-3],而且其在缺氧條件下無需外加有機碳源就可以實現脫氮,對于污水處理具有重要意義[2-3,5-7]. Anammox反應被證明發生在AnAOB特殊的亞細胞結構厭氧氨氧化體(Anammoxosome)中[8].厭氧氨氧化體占據細胞總體積的40%～70%,而且厭氧氨氧化體膜具有致密、相對不滲透性的特點,含有大量特殊的磷脂——梯烷脂(Ladderane lipids);AnAOB所有的細胞膜均含有梯烷脂[8-10].Damste等[9]通過理論計算表明以單一梯烷脂構成的磷脂雙分子層膜的密度達到了1.5kg/dm3,明顯高于其他一般細胞膜的密度(大多為1.2kg/dm3).梯烷脂含有3個或5個線性順式連接的環丁烷基團,該基團擁有獨特的CCC鍵角度和扭轉應變,純化后的梯烷脂能夠形成脂質堆積密度較高的液膜[9,11-13].至今為止,僅在AnAOB中發現了梯烷脂,因此它也被用作指示AnAOB和Anammox活動的生物標記物[14-25].

鑒于梯烷脂組成的厭氧氨氧化體膜通透性較低,梯烷脂的作用可能是避免Anammox過程中的有毒中間產物(例如肼或其他更大的有毒分子)從厭氧氨氧化體中擴散出來,從而保護細胞核酸和周質內容物免受損傷,維持正常代謝功能[9,26].除了避免有毒中間產物泄露外,梯烷脂的功能還可能是阻礙質子從厭氧氨氧化體中被動擴散出去.因為Anammox代謝緩慢,AnAOB需要致密的梯烷脂膜來維持合成ATP所需的質子動力勢[27].但是,對化學合成的天然梯烷脂的最新研究結果則表明,梯烷脂的功能極有可能是阻止質子動力勢的崩潰,而不是阻止肼在AnAOB中的跨膜擴散[28].綜上,基于現有的研究結果對于梯烷脂的生物功能假說主要分為兩類:(1)作為Anammox有毒中間產物的屏障;(2)維持質子動力勢.然而,由于目前尚未實現AnAOB的純培養,其基礎代謝研究較為困難,梯烷脂的生物功能和在Anammox反應中發揮的作用依然是一個謎.

厭氧氨氧化體是Anammox反應發生的主要場所[29-30],其膜的重要組成成分梯烷脂對于Anammox和AnAOB具有關鍵作用,而且梯烷脂可以成為可再生、高能量密度的航空燃料[11-12,31],因此梯烷脂的功能和可控人工合成研究具有重要的科學意義和工程應用前景[1].本文通過對AnAOB梯烷脂的結構、種類、功能、合成及其應用進行系統綜述,并指出梯烷脂研究的可能發展方向,旨在為深入研究梯烷脂的功能、生物合成和工程應用提供有價值的參考.

1 梯烷脂的結構與種類

Damste等[9]于2002年首次報道了AnAOB梯烷脂,這類物質是特殊的由甘油分子和含有環丁烷基團的烷烴支鏈結合而成的磷脂,由于線性連接的環丁烷基團的投影呈梯子狀,因此被稱為“梯烷” (Ladderane)(圖1).AnAOB菌體中的天然梯烷目前共發現有兩種分子結構,分別稱為X結構和Y結構(圖1)[9].甘油分子作為梯烷脂的骨架,其具有3個連接位點,分別是sn-1、sn-2、sn-3(圖1).sn-1位點可以連接氫、普通烷烴或梯烷支鏈(通過醚鍵或酯鍵連接烷基)等多種不同基團,sn-2位點通過醚鍵連接含有X結構的梯烷支鏈,而sn-3位點則可以與一個極性首基(Polar headgroup)相結合;如果sn-3位點連接有首基,被稱為完整梯烷脂(Intact ladderane lipids),失去首基但含有梯烷基團則被稱為核心梯烷脂(Core ladderane lipids)(圖2,Ⅰ和a-d)[9,14,29,32].由于細胞死亡后,磷脂會迅速分解,因此完整梯烷脂只來自AnAOB細菌活體,其適合用于指示正在進行的Anammox活動[19,33-34].核心梯烷脂相對穩定,可能來自AnAOB細菌活體,也可能來自凋亡的細菌,更適合用于重建古環境的Anammox活動[35].

完整梯烷脂的極性首基目前共發現3類,分別是磷酸膽堿(PC)、磷酸乙醇胺(PE)和磷酸甘油(PG)(圖1).Boumann等[32]檢測發現的富集培養物含有的完整梯烷脂的極性首基主要為PC和PE.Rattray等[14]則在4個不同屬(、、和)的AnAOB(表1)中都檢測到了PC和PE首基完整梯烷脂,并發現了PG首基.該研究還表明不同屬的AnAOB梯烷脂的組成有較大差異,這可能是由于物種或培養條件的差異所造成[14].此外, Rattray等[14]發現4個屬的AnAOB均含有C20梯烷脂和C18梯烷脂,而且C20梯烷脂是主要的梯烷脂.AnAOB的梯烷脂結構相對復雜且種類較多:首基和甘油骨架的組成結構共有10種,分別用羅馬數字I-X表示,而sn-1位點連接的尾部烷烴支鏈共有10種,分別用小寫英文字母a-j表示(圖2).

(A)線性串聯的環丁烷基團;(B)甘油骨架;(C)完整梯烷脂

表1 含有梯烷脂的AnAOB

目前對于梯烷脂的檢測和鑒定,主要局限在4個屬的AnAOB富集培養物,但是其他新發現的屬或科(例如[40-41]、[42]、[43]和[43])的AnAOB的梯烷脂的結構、種類或含量則未見報道.此外,浮霉菌門的細菌具有細胞器膜化和細胞壁缺少肽聚糖的獨特特征[44],因此除了AnAOB以外的其他浮霉菌門細菌(特別是可純培養的浮霉菌)的膜磷脂結構和種類值得進一步探究.

圖2 AnAOB富集培養物核心脂類和完整梯烷脂的類型[14]

2 梯烷脂在環境研究中的應用

如前所述,梯烷脂是AnAOB特有的磷脂,因此可以用作指示AnAOB和Anammox活動的生物標記物.截至目前,已有大量研究基于梯烷脂探究某一特定區域的AnAOB的分布或Anammox對氮循環的貢獻(表2).Kuypers等[20]首次利用梯烷脂作為生物標記物來指示海洋中的Anammox活動,結合氮同位素標記和熒光原位雜交技術(FISH),證明了AnAOB在海洋氮循環中發揮了重要作用.此外,許多海洋區域的沉積物中也檢測出梯烷脂,再次證明Anammox是海洋氮循環中的重要途徑[15,17,33,35]. Jaseschke等[35]利用海洋沉積物柱中的核心梯烷脂結合年代地層學技術重建了阿拉伯北部海域古環境的Anammox活動,結果表明Anammox活動在該海洋區域至少存在了14萬年.Zhao等[15]利用沉積物柱和懸浮微粒物質中的梯烷脂重建中國東海過去百年尺度的Anammox活動,并分析了梯烷脂對富營養化和缺氧的響應,認為梯烷脂可以作為中國東海過去缺氧變化的有效指示物質,同時能夠間接地用于沿海海洋區域富營養化記錄的重建.

目前利用梯烷脂作為生物標記物的研究對象主要是海洋環境,鮮見對其他環境(如湖泊、土壤等)的調查研究報道.此外,雖然先前的研究表明梯烷脂是研究海洋氮循環或缺氧的有效指示物,但是未來仍需進一步探究環境影響因素(如溶解氧、營養鹽濃度、溫度、水深等)和梯烷脂種類或含量之間的聯系.

表2 利用梯烷脂作為生物標記物探究自然環境中的厭氧氨氧化的研究

3 梯烷脂的合成

鑒于AnAOB梯烷脂的獨特性質、良好的環境研究和工業應用前景,因此揭示梯烷脂的生物合成通路和高效化學合成梯烷脂具有重要意義.總的來說,天然梯烷脂的生物合成通路至今仍然未知,需要進一步挖掘AnAOB膜磷脂的合成基因簇和相關通路,但是在化學合成天然或非天然梯烷(脂)方面目前已經取得了重要突破——現已開發出多種化學合成梯烷(脂)的方法.

3.1 生物合成

Damste等[51]首次提出了梯烷脂的生物合成假說:AnAOB首先合成C20多不飽和脂肪酸,然后C20多不飽和脂肪酸在C9和C20處環合形成C12大環,隨后形成CC單鍵,最終形成線性連接的環丁烷基團;由于梯烷脂基團的結構相似,可以通過增加或減少環化步驟的數量來合成含有3或5個環丁烷基團.Mascitti等[52]則認為梯烷生物合成可能通過級聯型多環化發生,該反應可能利用的底物是丙二烯系C20脂肪酸9,10,12,16,18,19-二十二碳六烯酸.此外,Nouri等[11]也提出了3種可能的需要六步多環化反應的梯烷脂生物合成機制.

細菌一般通過Ⅱ型脂肪酸合成(FASⅡ)通路進行飽和/不飽和脂肪酸的合成[53],梯烷脂有可能通過該通路合成.Strous等[54]發現在基因組中,脂肪酸生物合成功能基因分布在4個基因簇上,其中兩個基因簇由已知的FASⅡ和S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)自由基酶編碼基因的同源基因組成.由于SAM自由基酶編碼基因在細菌基因組中較為少見,而且這些酶通常負責催化困難的化學反應,所以他們認為這些基因簇最有可能負責梯烷脂的合成[54].

隨后,Rattray等[55]以模式細菌的基因組為參考通過比較基因組學的方法進一步鑒定了的脂肪酸合成基因,發現擁有除了、、和以外大部分的FASⅡ功能基因,同時它的FASⅡ基因簇中有6個基因編碼SAM自由基酶或甲基化酶(Methylase enzymes),有2個基因的產物和八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene dehydrogenases)有一定的同源性.此外,Rattray等[55]通過序列比對鑒定了其他137個物種是否擁有類似的FASⅡ基因簇,發現的這些基因簇稀少但并不唯一,屬于δ-變形菌綱的兩種細菌(和)具有類似的基因簇,并且除了擁有SAM自由基酶和八氫番茄紅素脫氫酶的同源編碼基因外,還有1個功能未知的膜蛋白和1個苯乙酰CoA連接酶(Phenylacetyl-CoA ligase)的編碼基因.然而,在細胞中并沒有發現梯烷脂,但是檢測到不常見的多不飽和碳氫化合物,該化合物在細胞中并未檢測到[55].基于上述的研究結果,Rattray等[55]提出了兩種C20-[5]-梯烷脂肪酸的生物合成通路(圖3):通路a,首先合成多不飽和碳氫化合物,然后經過SAM自由基酶的作用形成梯烷脂肪酸;通路b,梯烷基團通過未知的合成通路形成,然后進入到FASⅡ通路,最終形成梯烷脂肪酸.然而,對的碳同位素標記實驗結果表明,其梯烷脂的關鍵結構環丁烷和環己烷的碳原子不是通過已知的FASⅡ通路合成,因此梯烷基團更可能是通過未知的新通路合成[56].Chen等[57]通過量子化學計算探究了利用低聚環丙烷(Oligocyclopropane)作為前體生物合成梯烷的反應可行性,并認為一種涉及到混合機制的合成通路從自由能變的角度來看是較為合理的.

圖3 C20-[5]-梯烷脂肪酸的兩種生物合成通路[55]

2016年,Javidpour等[31]首次通過異源表達和鳥槍蛋白組學研究了先前在基因組中鑒定出的27個可能涉及到梯烷脂合成的基因的功能,盡管他們最終并沒有確定梯烷脂的合成基因(失敗的原因可能是部分候選基因未能有效表達、表達蛋白不能正確折疊或者選擇的宿主可能并非AnAOB基因最佳的異源表達宿主),但是在這項研究中他們建立起了有效的AnAOB基因異源表達載體構建方法.此外,Javidpour等[31]的研究結果表明先前被認為在梯烷脂合成中可能起到重要作用的去飽和酶(由基因kuste3336和kuste3607編碼,和八氫番茄紅素去飽和酶CrtI有大約30%的序列相似性)并不能將八氫番茄紅素去飽和產生番茄紅素.

當前,對于梯烷脂的生物合成功能基因的推測主要基于的比較基因組學研究結果,然而梯烷脂合成的碳同位素標記實驗對象是AnAOB另一個屬的,物種本身的差異可能導致合成通路的差異.因此,基于的實驗推論可能不適用于.后續可采用的富集培養物開展類似的碳同位素標記實驗,以檢驗Rattray等[55-56]提出的推論.此外,鑒于目前已有多個AnAOB(屬于確認含有梯烷脂的4個屬)的全基因組序列公布,可考慮對這些基因組進行比較基因組分析——鑒定它們所共有的核心脂肪酸合成基因簇,在Rattray等[55]的研究基礎上進一步鑒定可能的梯烷脂生物合成通路.Javidpour等[31]的結果為通過異源表達技術研究的梯烷脂合成基因建立了基礎,未來可考慮在此基礎之上優化啟動子和核糖體結合位點(RBS)序列,利用與AnAOB較為近緣的浮霉菌門細菌作為表達宿主.

3.2 化學合成

圖4 化學合成的梯烷(脂)

2004年,Mascitti等[58]首次報道了天然梯烷脂的關鍵結構之一(±)-[5]-梯烷酸(Ladderanoic acid)(圖4)的外消旋合成(Racemic synthesis)方法,關鍵步驟利用了光化學[2+2]-環加成和Wolff重排環收縮反應.而后,Mascitti等[52]繼續優化了合成策略于2006年報道了(±)-[5]-梯烷酸的拆分合成(Enantioselective synthesis)方法,即逐級連接環丁烷形成線性串聯的環丁烷基團.Mercer等[59]通過拆分合成方法化學合成了(-)-[5]-梯烷酸,同時第一次合成了天然梯烷脂的另一個關鍵結構[3]-梯烷醇(Ladderanol),而且首次通過化學合成和自組裝獲得了一種常見的天然梯烷脂——PC首基[5]-[3]-梯烷(圖4);他們提出的策略利用了基于Ramberg– B?cklund反應的環收縮和Zweifel烯基化反應,可以合成高純度和產量相對較多的天然梯烷脂,這將有助于梯烷脂的生物物理研究.Line等[60]通過拆分合成方法分為14個步驟合成了對映-[3]-梯烷醇.Moss等[28]則在先前Mercer等[59]的拆分合成方法基礎上,又合成了PC首基[3]-[3]-梯烷(最常見天然梯烷脂之一)和非天然結構的PC首基[5]-[5]-梯烷(圖4).最近,Hancock等[61]和Ray等[62]分別報道了改進的(+)-[5]-梯烷酸和[3]-梯烷醇的拆分合成策略.此外,還有一些關于非天然梯烷的化學合成研究報道[11,63-65].

盡管光化學[2+2]-環加成、基于Wolff重排和Ramberg–B?cklund反應的環收縮以及Zweifel烯基化反應已經被證明是切實可行的梯烷(脂)合成策略,但是由于應變引起的變形和迭代環丁烷組裝導致合成難度較高[64],未來仍然需要開發更為簡單可行的合成方法.梯烷脂的化學合成促進了一些新的合成方法和策略的開發,同時化學合成梯烷脂則在一定程度上提示了生物合成梯烷脂的可能前體和組裝過程,并且可以提供高純度的標準梯烷(脂),這將有助于梯烷脂的生物合成和功能研究.

4 影響梯烷脂生物合成的因素

梯烷脂是AnAOB磷脂膜的主要成分,其和AnAOB的生長狀態密切相關.已有相關研究表明,溫度是影響梯烷脂生物合成的重要因素,但其他可能的影響因素如鹽度、基質濃度、氧氣濃度等則鮮見報道.

從污水處理系統中富集得到的AnAOB大多是嗜中溫菌,生長溫度為20～43℃[66-67].但是在自然環境中,AnAOB生長溫度的范圍更廣.目前已經在北極海冰(溫度為-2.5℃)[45]、熱泉(溫度高達65℃)[48,68]、石油儲層(溫度高達75℃)[69]、深海熱液噴口區域(溫度高達85℃)[47]檢測到AnAOB或Anammox活動.此外,從海洋沉積物中富集的Scalindua屬的AnAOB可以在15～20℃生長[70].值得注意的是,從上述高溫環境中檢測到一些從污水系統中富集得到的嗜中溫AnAOB,說明這些AnAOB存在某些生理機制以適應環境溫度的變化.

其他含有脂肪酸的細菌會通過調整磷脂膜的組成維持細胞膜的流動性,以適應環境溫度的變化[71-74].AnAOB同樣表現出類似的溫度適應機制. Rattray等[37]研究了溫度對4種不同屬的AnAOB富集培養物梯烷脂的影響,發現隨著溫度的升高C20-[5]-梯烷脂肪酸相對于C18-[5]-梯烷脂肪酸的含量升高,而隨著溫度的降低,C18-[5]-梯烷脂肪酸相對于C20-[5]-梯烷脂肪酸的含量升高.基于該實驗結果,Rattray等[37]提出了NL5指數(式(1))來定量描述梯烷碳鏈長度的變化趨勢.

此外,他們還測定了其他處于不同溫度下的自然環境樣品的梯烷脂肪酸含量,發現NL5指數和樣品原位環境溫度具有強相關性,因此利用NL5指數有可能確定沉積物中梯烷脂的來源(原位或非原位產生)[37].對的冷適應策略研究發現,低溫對該物種梯烷脂的影響主要體現在3個方面:[5]-梯烷烷基的碳鏈長度減少、sn-1位點連接碳鏈更短的C14和C16非梯烷烷基以及PE首基的相對含量增加[38].Kouba等[39]對14種不同溫度下(10～37℃)的Anammox富集培養物梯烷脂的研究結果也表明隨著溫度降低AnAOB會減少[5]-梯烷烷基的碳鏈長度,而且還發現在低溫下AnAOB主要的無首基梯烷和完整梯烷脂并不匹配,這些無首基梯烷可能是與低溫適應有關的常規膜組分.上述研究的關注點主要為梯烷脂在溫度改變時的變化,后續可基于梯烷脂生物合成通路的研究結果探究不同溫度下候選梯烷脂合成基因/蛋白的表達量和梯烷脂含量及種類的變化,為揭示其合成通路提供重要依據.

5 總結與展望

梯烷脂是AnAOB獨有的膜磷脂且相對含量較高,在4種不同屬的AnAOB富集培養物中都可以檢測到,能夠作為指示AnAOB和Anammox活動的生物標記物,還可以作為可再生、高能量密度的航空燃料.從發現梯烷脂以來,已取得許多重要的研究進展,這些加深了人們對AnAOB、Anammox及地球氮循環的認識,然而關于AnAOB梯烷脂仍然存在很多問題亟待解決,未來可開展如下研究:

5.1 可利用梯烷脂結合基因分子標記物探明AnAOB的種類和分布環境,研究特定環境中的氮循環過程以及評估Anammox對氮循環的貢獻,還可以結合年代地層學和其他指標,重建古環境的地球化學演化規律.

5.2 梯烷脂是反映海洋缺氧事件的有效指示物,然而梯烷脂如何定量反映特定環境過去及現在的缺氧和富營養化事件,以及人類活動對水體環境的影響是值得深入探討的問題.這可為未來生態環境變化預測提供有價值的理論依據.

5.3 目前僅在AnAOB中檢測到梯烷脂,但是其他細菌類群或是古菌是否含有梯烷脂仍然是后續研究中應該關注的問題.

5.4 一些AnAOB新的種、屬以及科陸續被發現,因此值得探究這些新的AnAOB是否也含有梯烷脂;如果檢測到梯烷脂,則需要關注它們的梯烷脂含量、結構及種類,這將有助于揭示梯烷脂在Anammox過程中發揮的作用.

5.5 雖然化學合成的天然梯烷脂的通透性研究表明梯烷脂的功能很可能是阻止厭氧氨氧化體內部質子動力勢的崩潰,但是這僅僅是基于兩種天然梯烷脂的實驗結果的推論,今后需要對其他的天然梯烷脂進行生物物理學表征以進一步檢驗該推論的正確性.此外,基于該推論,如何通過厭氧氨氧化體膜形成質子動力勢則是待解答的另一個問題.

5.6 當前對于梯烷脂生物功能的假說之一是主要由梯烷脂構成的厭氧氨氧化體膜可以作為Anammox有毒中間產物肼的屏障.厭氧氨氧化體膜的組成較為復雜,而且AnAOB菌體內的其他細胞膜也含有梯烷脂,因此當前基于兩種單一梯烷脂的體外膜滲透性實驗結果仍不足以推翻上述假說.相比之下,活體的功能研究更具有說服力.可以考慮采用密度梯度離心技術獲得高純度的AnAOB菌體,進而分離出厭氧氨氧化體及其他細胞組分,檢測各個組分中肼和其他Anammox中間產物的含量,相關結果將有助于檢驗上述假說的正確性.

5.7 比較基因組學和碳同位素標記分析初步揭示了梯烷脂的生物合成通路,但是梯烷脂(特別是關鍵結構串聯的環丁烷基團)的生物合成通路仍然有待闡明.因此,可以采用合適的技術方法如新的標記底物或標記方法、宏蛋白質組學、脂質組學、異源表達等深入挖掘梯烷脂的合成通路.而后,在梯烷脂的生物合成通路得到闡明的基礎上,利用合成生物學技術和工程菌規模化生產梯烷脂,進而將其應用到工業生產領域.

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Research advances in ladderane lipids of anammox bacteria.

WANGYi-cheng, YAN Peng, CHEN You-peng*

(College of Environment and Ecology, Chongqing University, Chongqing 400045, China)., 2023,43(9)：4886～4895

Anaerobic ammonium-oxidizing bacteria (AnAOB) play an important role in the global nitrogen cycle and environmental pollution control. AnAOB contain unique ladderane lipids, whose key structure is three or five linearly concatenated cyclobutane moieties. Ladderane lipids have not been found in other bacteria so far, and their biosynthetic pathway and physiological function remain unknown. In this work, the advances in the discovery, structure, properties, types, applications, and synthesis of AnAOB ladderane lipids were comprehensively reviewed, and the current issues and prospected future research directions were discussed.

anaerobic ammonium-oxidizing bacteria；phospholipids；ladderane lipids；cyclobutane；biosynthesis；biomarker

X172

A

1000-6923(2023)09-4886-10

王乙橙(1996-),男,重慶涪陵人,博士研究生,研究方向為環境微生物技術.發表論文3篇.bitmatrix@yeah.net.

王乙橙,晏 鵬,陳猷鵬.厭氧氨氧化細菌梯烷脂的研究進展 [J]. 中國環境科學, 2023,43(9):4886-4895.

WangY C, Yan P, Chen Y P.Research advances in ladderane lipids of anammox bacteria [J]. China Environmental Science, 2023,43(9):4886-4895.

2023-02-14

國家自然科學基金資助項目(21876016,52070031)

* 責任作者, 教授, ypchen@cqu.edu.cn