基于RhoA/ROCK通路探討電針心包經穴對急性腦缺血大鼠神經軸突生長抑制因子的影響

唐雅妮，肖豆 ，馬文娟 ，謝崢嶸 ，潘江 ，婁必丹 ，章薇 ，陳成

1.長沙民政職業技術學院，湖南 長沙 410004；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；3.同濟大學附屬楊浦醫院，上海 200090；4.長沙市中醫醫院，湖南 長沙 410100

急性腦缺血是由不同原因導致大腦供血動脈狹窄或閉塞而出現腦部供血障礙，繼而引起神經功能障礙或腦組織缺血性壞死，是腦卒中最常見的類型，約75%的患者會發生與神經相關的功能障礙[1-2]。腦缺血后功能的恢復與神經修復和再生有關[3]，缺血損傷后神經生長抑制因子表達升高是導致神經再生障礙的關鍵原因[4]。研究發現，Ras同源基因家族成員A（RhoA）及其下游效應因子Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK）Ⅱ參與神經軸突出芽、生長等生理過程，RhoA/ROCK通路可以調控神經軸突損傷后的再生[5]。針灸作為補充和替代療法，能有效治療缺血性腦卒中[6-8]，改善神經功能缺損及相關功能障礙[9]，通過調節中樞神經系統，特別是神經再生、修復和改善神經元突觸功能，對腦缺血損傷產生有益影響[10-12]。本研究在前期研究[13-16]基礎上，從RhoA、ROCKⅡ角度探討電針心包經穴對急性腦缺血大鼠的神經修復作用及機制，為臨床從心治腦提供實驗依據與相關理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級成年雄性SD大鼠90只，體質量（235±15）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養于溫度（22±2）℃、相對濕度55%～70%環境，自然光照，適應性飼養1周后開始實驗，造模前禁食24 h。

1.2 主要試劑與儀器

大鼠RhoA ELISA試劑盒（上海酶聯，貨號ml038156），ROCKⅡ ELISA試劑盒（武漢華美，貨號CSB-EL020059RA），二步法試劑盒（北京中杉金橋，貨號PV-9003），DBA試劑盒（北京中杉金橋，貨號ZLI-9018），β-actin抗體（美國Proteintech，貨號66009-1-Ig），RhoA抗體（美國Proteintech，貨號10749-1-AP），ROCKⅡ抗體（美國Proteintech，貨號21645-1-AP），HRP標記羊抗鼠二抗（美國Proteintech，貨號SA00001-1），HRP標記羊抗兔二抗（美國Proteintech，貨號SA00001-2），反轉錄試劑盒（中國北京康為世紀，貨號CW2569），Trizol（美國Thermo，貨號15596026）。0.30 mm×15 mm一次性華佗牌毫針、SDZ-Ⅱ型華佗電針治療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）；H1650R型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀）；PW-812型全自動酶標洗板機（深圳匯松）；MB-530型多功能酶標分析儀（深圳匯松）；PIKO REAL 96型熒光定量RCP儀（美國Thermo）；SPL0960型熒光PCR板（美國Thermo）；DYY-6C型電泳儀（北京六一）；DYCZ-40D型轉膜儀（北京六一）。

1.3 分組與造模

采用隨機數字表法將90只大鼠隨機分為空白組18只、假手術組18只、造模組54只。造模成功后，將造模組隨機分為模型組、心包經組和肺經組，每組18只。各組再隨機分配至干預7、14、21d 3個時間點，每個時間點6只。

根據Zea Longa方法[17]，并結合前期研究[13-16]，采用頸外動脈插入線栓法建立大腦中動脈栓塞（MCAO）模型。空白組僅捆綁處理，假手術組只分離血管不插入栓線。造模完成后24 h采用Zea Longa 5級4分制評分法對大鼠進行神經功能缺損評分，選取評分為1～3分大鼠納入實驗。

1.4 干預

根據手三陰經“從胸走手”循行方向，選取大鼠癱瘓側肢體不同神經節段的常用腧穴代表心包經和肺經。以“天泉”“曲澤”“內關”“大陵”代表心包經、“天府”“尺澤”“列缺”“太淵”代表肺經，腧穴定位參照《實驗針灸學》[18]。造模成功后次日開始針刺，毫針刺入大鼠上肢癱瘓側穴位，針刺深度3～4 mm，接電針治療儀。心包經組以“天泉”“曲澤”為一組，“內關”“大陵”為一組；肺經組以“天府”“尺澤”為一組，“列缺”“太淵”為一組。正極接近心端腧穴，負極接遠心端腧穴，選用連續波，頻率20 Hz，輸出電壓2～4 V，電流強度4～6 mA，以大鼠上肢輕顫為度，刺激時間30 min/次，連續干預6 d，間隔1 d，共21 d。

1.5 指標檢測

1.5.1 HE染色

干預結束后，大鼠用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，斷頭，取梗死區腦組織，用乙醇和二甲苯脫水，石蠟包埋并切片，烤片脫蠟，水化后用蘇木精-伊紅染色，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.5.2 ELISA檢測

大鼠麻醉處死后，取腹主動脈血4～5 mL，4 ℃、3000 r/min離心15 min，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，根據標準品的吸光度制作標準曲線，計算血清RhoA、ROCKⅡ含量。

1.5.3 免疫組化染色

按照免疫組化試劑盒說明操作，標本采集后常規制作石蠟切片，抗原熱修復后滴加RhoA、ROCKⅡ一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，滴加二抗（1∶200），37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，各級乙醇脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察梗死區腦組織陽性表達（黃色、棕黃色或褐色染色），每張切片隨機觀察5個不重疊視野，采集圖像后用Image-Pro Plus 6.0軟件測定陽性表達的平均光密度。

1.5.4 RT-PCR檢測

取梗死區腦組織，提取組織總RNA，紫外分光光度計測定濃度，將RNA反轉錄合成cDNA，進行RTPCR擴增，運用primer5軟件設計引物（見表1）。以β-actin為內參，2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列

1.5.5 Western blot檢測

取梗死區腦組織，每100 mg組織加入RIPA裂解液1 mL，吸取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液加熱、變性后，進行電泳，轉移至NC膜，5%脫脂奶粉室溫密封60 min，加入RhoA一抗（1∶1000）、ROCKⅡ一抗（1∶3000）、β-actin一抗（1∶5000），4 ℃孵育過夜。洗膜，與HRP標記二抗室溫孵育90 min。用ECL化學發光液曝光后顯影。采用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以目標蛋白與內參蛋白的灰度值比值計算目標蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，數據符合正態分布用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Tambane's T2 或Games-Howell法；不符合正態分布用多個獨立樣本比較的秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針對模型大鼠梗死區腦組織病理形態的影響

空白組、假手術組大鼠腦組織神經元結構完整，細胞胞漿豐富，核仁清晰；模型組大鼠腦組織神經細胞數量減少，細胞核固縮，間質染色稀疏；與模型組比較，心包經組和肺經組大鼠腦組織神經細胞形態有所改善，核固縮程度減輕，神經元數量增加，心包經組改善更為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠梗死區腦組織形態（HE染色，×400）

2.2 電針對模型大鼠血清RhoA、ROCKⅡ含量的影響

與空白組、假手術組同一時點比較，模型組大鼠各時點血清RhoA、ROCKⅡ含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組同一時點比較，心包經組大鼠各時點血清RhoA含量明顯減少（P＜0.05），14、21 d血清ROCKⅡ含量明顯減少（P＜0.01）；與肺經組同一時點比較，心包經組大鼠7、14 d血清RhoA含量明顯減少（P＜0.01），14、21 d血清ROCKⅡ含量明顯減少（P＜0.01，P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠血清RhoA、ROCKⅡ含量比較（±s，每組6只）

2.3 電針對模型大鼠梗死區腦組織RhoA和ROCKⅡ表達的影響

與空白組、假手術組同一時點比較，模型組大鼠各時點梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組同一時點比較，心包經組大鼠各時點梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ表達明顯降低（P＜0.01），肺經組大鼠14、21 d梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與肺經組同一時點比較，心包經組大鼠14、21 d梗死區腦組織RhoA表達明顯降低（P＜0.05），各時點ROCKⅡ表達明顯降低（P＜0.01）。見圖3～圖5。

圖3 各組大鼠梗死區腦組織RhoA陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖4 各組大鼠梗死區腦組織ROCKⅡ陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖5 各組大鼠梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ表達比較（±s，每組6只）

2.4 電針對模型大鼠梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡmRNA表達的影響

與空白組、假手術組同一時點比較，模型組大鼠各時點梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ mRNA表達升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組同一時點比較，心包經組大鼠各時點梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ mRNA表達降低，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；與肺經組同一時點比較，心包經組大鼠21 d梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ mRNA表達降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖6。

圖6 各組大鼠梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ mRNA表達比較（±s，每組6只）

2.5 電針對模型大鼠梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ蛋白表達的影響

與空白組、假手術組同一時點比較，模型組大鼠各時點腦組織梗死區RhoA、ROCKⅡ蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組同一時點比較，心包經組大鼠各時點腦組織梗死區RhoA、ROCKⅡ蛋白的表達均降低（P＜0.05，P＜0.01），肺經組7、14 d RhoA蛋白表達明顯降低（P＜0.05），21 d ROCKⅡ蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；與肺經組同一時點比較，心包經組大鼠各時點梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ蛋白表達明顯降低（P＜0.01）。見圖7、圖8。

圖7 各組大鼠梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ蛋白免疫印跡

圖8 各組大鼠腦組織梗死區RhoA、ROCKⅡ蛋白表達比較（±s，每組6只）

3 討論

腦缺血的繼發性損害因素有多種，大腦一旦發生梗死，由于中樞神經系統的修復與再生能力有限，神經損傷后很難完全恢復。中樞神經系統損傷的修復受神經因子促進因素與神經軸突生長抑制因素的雙重調節，因此有效抑制神經軸突生長抑制因子的表達是促進神經功能恢復的重要途徑，對腦卒中神經軸突重建和恢復具有重要意義[19]。研究表明，電針“神庭”“百會”能降低海馬組織RhoA蛋白表達，改善MCAO大鼠學習記憶能力[20]。作為治療缺血性腦卒中的靶點，ROCK抑制劑已被證實通過改變炎癥、血小板、內皮功能、平滑肌收縮和神經元再生，在神經保護、腦卒中預防和恢復方面發揮有益作用[21]。ROCKⅠ主要在非神經元組織中表達，ROCKⅡ主要在腦和脊髓中表達。故本實驗以RhoA、ROCKⅡ為切入點，研究電針心包經穴對急性腦缺血大鼠神經軸突生長抑制因子的影響。

RhoA/ROCK信號通路激活會抑制神經軸突生長，因此，下調NogoA/RhoA/ROCK通路可消除抑制急性腦缺血后神經再生的障礙[22]。Nogo-A與其受體蛋白NgR結合后，啟動下游RhoA/ROCK信號通路，從而抑制軸突生長，阻礙神經修復和再生[23]。RhoA是小G蛋白超家族中Rho家族亞族的成員，ROCK是Rho GTP酶的下游效應分子。RhoA通過激活肌動蛋白抑制軸突生長，因此，神經元中RhoA缺失時會刺激神經軸突再生反應[24]。神經樹突、軸突的生長和軸突的導向都離不開RhoA磷酸化，磷酸化后的RhoA被激活，腦缺血可使失活的RhoA蛋白被激活，進而刺激下游效應分子ROCK，變為活化狀態的ROCK與GTP結合體，活化狀態的ROCK將激活ROCK底物[25]。Yamashita等[26]發現，在急性腦缺血大鼠中神經元軸突ROCKⅡ表達和活性均增加，說明ROCKⅡ在缺血性神經元損傷中起關鍵作用。

本研究結果顯示，模型組大鼠各時點梗死區腦組織神經細胞數量減少、結構紊亂，且血清RhoA、ROCKⅡ含量及梗死區腦組織mRNA和蛋白表達均高于空白組和假手術組，提示急性腦缺血后導致大鼠神經軸突生長抑制因子增加，可能與RhoA/ROCK通路激活有關。心包經組大鼠梗死區腦組織神經細胞形態改善，且血清RhoA、ROCKⅡ含量及梗死區腦組織mRNA和蛋白表達均低于模型組，提示電針心包經穴能改善細胞形態，下調神經軸突生長抑制因子表達，其機制可能與抑制RhoA/ROCK通路激活有關。且電針心包經穴下調神經軸突生長抑制因子表達效果優于電針肺經穴，可能與經脈具有特異性有關。謝崢嶸等[27-28]研究電針手厥陰心包經穴對MCAO大鼠不同時點腦組織SYP、PSD-95及神經生長抑制因子表達的影響也證實了腦缺血后電針心包經穴優于肺經穴。

綜合本實驗結果，電針心包經穴能下調急性腦缺血大鼠血清RhoA、ROCKⅡ含量及梗死區腦組織RhoA、ROCKⅡ表達，其機制可能與抑制RhoA/ROCK通路激活相關。