半夏瀉心湯含藥血清對胃癌細胞外泌體誘導的腹膜間皮細胞FN1、LAMC1表達及胃癌細胞與腹膜間皮細胞黏附、侵襲的影響

丁富勇 ，劉喜平 ，陳啟明 ，戴麗蓉 ，王慶苗 ，施麗娟 ，朱中博 ，何玲

1.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000； 3.蘭州大學第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

半夏瀉心湯是治療寒熱錯雜痞證的經(jīng)典名方，出自《傷寒雜病論》，具有平調(diào)寒熱、消痞散結之效。用于治療肝癌、胃癌等消化道腫瘤及復發(fā)轉(zhuǎn)移已有眾多臨床報道[1-3]，療效肯定。本課題組前期實驗研究表明，半夏瀉心湯對胃癌荷瘤裸鼠有明顯抑瘤作用[4]，且可抑制人胃癌細胞生長增殖[5-6]。同時研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯含藥血清可保護胃癌上清液對腹膜間皮細胞的損傷[7]，抑制人胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移潛能細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[8]。本研究在前期研究基礎上，分離人胃癌NCI-N87細胞外泌體，通過NCI-N87細胞外泌體誘導人腹膜間皮細胞HMrSV5，觀察半夏瀉心湯含藥血清對胃癌細胞來源外泌體誘導的腹膜間皮細胞纖維連接蛋白1（FN1）和層粘連蛋白γ1（LAMC1）表達及胃癌細胞與腹膜間皮細胞黏附、侵襲的影響，探討半夏瀉心湯防治胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的機制。

1 實驗材料

1.1 藥物

半夏瀉心湯（法半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，黃連3 g，人參9 g，大棗4枚，炙甘草9 g），飲片由甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院景明教授鑒定符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。全方藥物混合并浸泡30 min，煎煮2次，第1次加8倍量水，煎煮1.5 h，第2次加6倍量水，煎煮1 h，合并煎液，過濾，濾液減壓濃縮至原藥材濃度為2.7、1.35、0.675 g/mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動物與細胞

SPF級雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2020-0001，動物使用許可證號SYXK（甘）2020-0009。飼養(yǎng)于溫度23～25 ℃、相對濕度50%±10%的SPF級實驗室。本研究動物實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（2018-009）。

人腹膜間皮細胞HMrSV5、人胃癌NCI-N87細胞，購自上海中科院細胞庫，傳至第3代備用。

1.3 試劑與儀器

FN1 ELISA檢測試劑盒（深圳子科生物科技有限公司，批號ZK-H1730），LAMC1 ELISA檢測試劑盒（上海研尊生物科技有限公司，批號YZ-E987777），BCA蛋白定量試劑盒（上海易色醫(yī)療科技有限公司，批號BC201），外泌體提取試劑盒（美國SBI，批號EXOTC50A-1），RNA提取試劑盒（日本Takara公司，批號9767），兔來源CD63一抗（英國Abcam公司，批號ab134045），兔來源CD9一抗（英國Abcam公司，批號ab92726），兔來源鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin）一抗（英國Abcam公司，批號ab92516），羊抗兔IgG（英國Abcam公司，批號ab150077），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號11995-065），胎牛血清（美國Gibco公司，批號HLC0101），基質(zhì)膠（美國Corning公司，批號356234），CFSE染色劑（美國Bioscience公司，批號65-0850-84）。

7500型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司），ECLIPSE Ti型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），TDL-50B型低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），353097型8 μm Transwell小室（美國Costar公司），實時熒光定量PCR儀（美國ABI Stepone plus公司），DYCP-31DN型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），Trans-blot轉(zhuǎn)膜裝置（美國Bio-Rad公司），Tanon-4200型凝膠成像系統(tǒng)（中國Tanon公司），Multiskan Mk3酶標儀（賽默飛世爾儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備

按照前期方法制備半夏瀉心湯[9]和5-氟尿嘧啶（5-FU）[10]含藥血清，將40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、5-FU組和半夏瀉心湯低、中、高劑量組，每組8只。適應性飼養(yǎng)5 d后，半夏瀉心湯低、中、高劑量組每日分別予相應溶液13.5、27、54 g/kg灌胃，其余各組灌胃等體積生理鹽水，2 mL/次，2次/d；5-FU組按0.015 g/kg尾靜脈注射5-FU注射液（0.125 g/5 mL），其余各組注射等體積空白溶劑，連續(xù)2周。末次給藥后1 h，3%戊巴比妥鈉1.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采集全血，靜置分層后3000 r/min離心10 min，收集血清，56 ℃水浴滅活30 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，混勻分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩ＥR用時配制成10%含藥血清。

2.2 NCI-N87細胞外泌體分離

用無外泌體完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素）培養(yǎng)NCI-N87細胞后，4 ℃、1500 r/min離心5 min，收集細胞培養(yǎng)上清液，4 ℃、5000 r/min離心20 min，0.22 μm濾膜過濾去除較大囊泡，將過濾后的細胞上清液與外泌體提取試劑以5∶1比例混勻，4 ℃孵育過夜，10000 r/min低速離心30 min，棄上清液，所得沉淀用0.5 mL無菌PBS重懸，即得外泌體。取適量外泌體，采用BCA蛋白定量試劑盒進行定量后，于-80 ℃冰箱保存。

2.3 NCI-N87細胞外泌體鑒定

將外泌體以PBS稀釋至合適濃度，加入Formvarcarbon載樣銅網(wǎng)上，將銅網(wǎng)用2.5%戊二醛固定，移至包被碳膜的微柵網(wǎng)，滴加草酸雙氧鈾及甲基纖維素-UA液50 μL，置于透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)，80 kV拍照并保存。

取外泌體和NCI-N87細胞，加入6×蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min變性，以20 μg總蛋白上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、洗滌、封閉后，分別加CD9、CD63、calreticulin一抗（1∶1000），4 ℃孵育過夜，洗滌，室溫孵育二抗（1∶1000）2 h，洗滌，ECL化學發(fā)光液（A液與B液等比例混合）顯影，Image J軟件分析CD9、CD63、calreticulin蛋白灰度值。

2.4 ELISA檢測HMrSV5細胞纖維連接蛋白1和層粘連蛋白γ1含量

將對數(shù)期HMrSV5細胞用胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為濃度2×105個/mL，將細胞懸液接種于6孔板，每孔100 μL，將細胞分為正常對照組、模型組、5-FU組和半夏瀉心湯低、中、高劑量組，每組3個復孔。將“2.2”項下分離的NCI-N87細胞外泌體用含相應大鼠血清的完全培養(yǎng)基稀釋[11]，正常對照組加入10%正常對照大鼠血清培養(yǎng)基（無外泌體）1 mL，模型組加入10%正常對照大鼠血清培養(yǎng)基（外泌體濃度為100 μg/mL）1 mL，5-FU組加入10%5-FU大鼠血清培養(yǎng)基（外泌體濃度為100 μg/mL）1 mL，半夏瀉心湯低、中、高劑量組分別加入10%半夏瀉心湯低、中、高劑量含藥血清培養(yǎng)基（外泌體濃度均為100 μg/mL）1 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于24、48、72 h后終止培養(yǎng)，收集細胞上清液，10000 r/min離心15 min，去除細胞碎片，按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測FN1和LAMC1含量。

2.5 RT-qPCR檢測HMrSV5細胞纖維連接蛋白1和層粘連蛋白γ1 mRNA表達

收集“2.4”項下培養(yǎng)72 h的HMrSV5細胞，使用Trizol試劑提取總RNA。取5 μg RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，采用熒光定量PCR試劑盒進行PCR。反應條件：50 ℃、2 min，95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，計算循環(huán)閾值（Ct），采用2-ΔΔCt法計算FN1、LAMC1 mRNA相對表達量。引物由重慶威斯騰科技公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.6 NCI-N87細胞和HMrSV5細胞黏附檢測

取對數(shù)期NCI-N87細胞，胰酶消化，收集細胞沉淀，PBS洗2遍，加入適量5 μmol/L CFSE染液避光孵育20 min。收集CFSE標記的胃癌細胞，用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，避光備用。將NCI-N87細胞懸液100 μL加入“2.4”項下分組培養(yǎng)72 h的HMrSV5細胞中，同時設置空白孔（含10%正常對照大鼠血清的完全培養(yǎng)基）及對照孔（NCI-N87細胞懸液100 μL），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h。棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，洗脫未結合的NCI-N87細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞黏附情況，熒光酶標儀激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長530 nm讀取各孔熒光強度，計算細胞黏附率。細胞黏附率（%）=（實驗組熒光強度-空白孔熒光強度）÷（對照孔熒光強度-空白孔熒光強度）×100%。

2.7 NCI-N87細胞對HMrSV5細胞侵襲檢測

在Transwell上室加入稀釋的基質(zhì)膠50 μL，將密度為5×104個/mL NCI-N87細胞懸液200 μL接種到Transwell上室，下室接種“2.4”項下培養(yǎng)72 h的HMrSV5細胞（密度2×105個/mL）0.5 mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。取出Transwell小室，棄去培養(yǎng)基，以無菌棉棒輕輕擦去上室殘留細胞，用4%多聚甲醛固定上室底面細胞，室溫放置15 min，PBS洗去固定液，結晶紫染色30 min，PBS沖洗后顯微鏡下觀察并拍照，在100倍視野下，對膜中間和四周5個視野的染色細胞進行計數(shù)，取平均值。

3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以±s表示，組間比較經(jīng)方差齊性檢驗后用方差分析并進行多重比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 外泌體鑒定

透射電鏡觀察到NCI-N87細胞外泌體有完整的雙層包膜，形成橢圓或碟狀的囊泡結構，內(nèi)含低密度物質(zhì)，粒徑介于40～80 nm，見圖1。

圖1 NCI-N87細胞外泌體形態(tài)

CD9、CD63是外泌體標志蛋白，calreticulin是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)主要的鈣離子結合蛋白。Western blot檢測結果顯示，外泌體CD9、CD63蛋白表達明顯高于NCI-N87細胞，而calreticulin蛋白表達明顯低于NCI-N87細胞，見圖2。提示獲得了NCI-N87細胞來源外泌體。

圖2 NCI-N87細胞及外泌體CD9、CD63、calreticulin蛋白免疫印跡

4.2 半夏瀉心湯含藥血清對HMrSV5細胞纖維連接蛋白1和層粘連蛋白γ1含量的影響

與正常對照組比較，各時間點模型組HMrSV5細胞上清液FN1和LAMC1含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組HMrSV5細胞上清液FN1和LAMC1含量明顯減少（P＜0.01）；與本組48 h比較，培養(yǎng)72 h HMrSV5細胞上清液FN1和LAMC1含量明顯增加（P＜0.01），見表2。因此后續(xù)實驗選擇含藥血清培養(yǎng)72 h。

表2 各組HMrSV5細胞上清液FN1和LAMC1含量比較（±s，ng/mL）

表2 各組HMrSV5細胞上清液FN1和LAMC1含量比較（±s，ng/mL）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與48 h比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常對照組模型組5-FU組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組n333333 FN1 LAMC172 h 0.12±0.019.65±0.45##2.80±0.36**6.07±0.61**△△5.09±0.35**△△3.42±0.63**△△24 h 13.12±0.2220.12±0.12##10.68±0.24**13.41±0.17**△△14.41±0.33**△△13.67±0.23**△△48 h 16.34±0.1525.64±0.24##16.56±0.37**19.82±0.42**17.38±0.12**18.12±0.45**72 h 25.36±0.3248.80±0.55##30.30±0.14**39.16±0.33**△△38.46±0.63**△△32.12±0.42**△△24 h 0.05±0.025.43±0.41##0.78±0.23**2.45±0.58**△1.46±0.32**△0.87±0.43**48 h 0.07±0.236.37±0.23##1.17±0.25**3.42±0.45**2.34±0.26**1.34±0.32**

4.3 半夏瀉心湯含藥血清對HMrSV5細胞纖維連接蛋白1和層粘連蛋白γ1 mRNA表達的影響

與正常對照組比較，模型組HMrSV5細胞FN1和LAMC1 mRNA表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組HMrSV5細胞FN1和LAMC1 mRNA表達明顯降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組HMrSV5細胞FN1和LAMC1 mRNA表達比較（±s）

表3 各組HMrSV5細胞FN1和LAMC1 mRNA表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

LAMC11.00±0.013.45±0.03##1.06±0.03**3.27±0.01**2.24±0.02**2.01±0.04**組別正常對照組模型組5-FU組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組n333333 FN11.00±0.035.00±0.05##3.03±0.04**5.61±0.07**4.64±0.06**4.12±0.02**

4.4 半夏瀉心湯含藥血清對NCI-N87細胞和HMrSV5細胞黏附的影響

與正常對照組比較，模型組NCI-N87細胞和HMrSV5細胞黏附率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，半夏瀉心湯中、高劑量組NCI-N87細胞和HMrSV5細胞黏附率明顯降低（P＜0.01）。見圖3、表4。

圖3 各組NCI-N87、HMrSV5細胞黏附（CFSE染色，×100）

表4 各組NCI-N87、HMrSV5細胞黏附率比較（±s，%）

表4 各組NCI-N87、HMrSV5細胞黏附率比較（±s，%）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

黏附率12.29±0.9731.03±1.12##8.08±0.45**23.48±1.3418.83±1.09**15.10±0.94**組別正常對照組模型組5-FU組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組n333333

4.5 半夏瀉心湯含藥血清對NCI-N87細胞向HMrSV5細胞侵襲的影響

與正常對照組比較，模型組NCI-N87細胞向HMrSV5細胞侵襲數(shù)量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，半夏瀉心湯低、中、高劑量組NCI-N87細胞向HMrSV5細胞侵襲數(shù)量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4、表5。

圖4 各組NCI-N87細胞向HMrSV5細胞侵襲（結晶紫染色，×100）

表5 各組NCI-N87細胞向HMrSV5細胞侵襲數(shù)量比較（±s，個）

表5 各組NCI-N87細胞向HMrSV5細胞侵襲數(shù)量比較（±s，個）

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

侵襲數(shù)量20.20±5.6154.27±4.28##22.55±5.23**40.67±3.14*34.07±2.34**26.53±1.14**組別正常對照組模型組5-FU組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組n333333

5 討論

腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌患者最常見的復發(fā)形式之一[12]，其中癌細胞從原發(fā)腫瘤剝離形成游離癌細胞，并與腹膜間皮細胞黏附，進而侵入腹膜是形成腹膜轉(zhuǎn)移的關鍵環(huán)節(jié)。腹膜間皮細胞是覆蓋在腹膜最表層的細胞，是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移種植的抵御屏障[13]。已有研究表明，腹膜內(nèi)游離癌細胞存在并不一定發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，腹膜間皮細胞表型和功能改變是促進游離癌細胞與腹膜間皮細胞黏附、增強癌細胞侵襲和遷移能力的關鍵因素[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在癌細胞定植于腹膜間皮細胞前，腹膜間皮細胞已發(fā)生表型和功能改變，為癌細胞轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利微環(huán)境[15]。

胃癌腹膜轉(zhuǎn)移主要病機為脾胃升降失調(diào)，半夏瀉心湯為辛開苦降法的代表方劑，方中法半夏、干姜辛開以化痰散結，黃連、黃芩苦降以清解癌毒，人參、大棗、甘草甘補以健脾補虛。全方寒熱互用以和其陰陽、辛開苦降以調(diào)其升降、補瀉兼施以顧其虛實，共奏化痰散結、健脾補虛、清解癌毒之功。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯能有效預防胃癌根治術后腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移[3]，保護胃癌上清液對腹膜間皮細胞的損傷[7]，抑制人胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移潛能細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移[8，16]。

外泌體是一類直徑為50～100 nm的內(nèi)吞衍生囊泡，是細胞間通訊的重要載體，各種類型細胞均可分泌外泌體，相對于普通細胞，癌細胞可分泌大量外泌體，在促進腫瘤轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用[17-18]。外泌體可富集、包裹細胞外的miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)、細胞因子等多種生物信息物質(zhì)，并將其遠距離傳遞至受體細胞，內(nèi)化后激活胞內(nèi)信號通路及蛋白表達，對受體細胞生物學特性進行精細調(diào)節(jié)[19]。研究表明，胃癌患者血液中外泌體含量較健康人群明顯增加，且其攜帶的生物信息物質(zhì)與健康人群也明顯不同[20]，并證實胃癌來源的外泌體能誘發(fā)腹膜間皮細表型和功能改變，參與癌細胞在腹膜擴散發(fā)展，促進胃癌腹膜轉(zhuǎn)移[21]。

FN1是大分子的細胞外基質(zhì)糖蛋白，LAMC1是存在于基底膜中的非膠原糖蛋白，2種蛋白均參與多種生物過程，包括組織、胚胎發(fā)育，傷口愈合等[22-23]，尤其FN1是促進幾乎所有種類癌細胞形成和發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子[24]。同時，F(xiàn)N1和LAMC1作為重要的細胞黏附相關分子，通過細胞外基質(zhì)中精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸組成的短肽序列識別整合素家族介導的細胞黏附與遷移，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[25-26]。PCR陣列表明，F(xiàn)N1和LAMC1在腫瘤來源外泌體誘導的腹膜間皮細胞中表達顯著上調(diào)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N1和LAMC1表達上調(diào)與外泌體中miRNA等生物信息物質(zhì)向腹膜間皮細胞傳遞有關[27]。

本研究結果顯示，在胃癌細胞NCI-N87來源外泌體誘導下，各劑量半夏瀉心湯均可減弱NCI-N87細胞與腹膜間皮細胞HMrSV5黏附能力及胃癌細胞的侵襲能力，降低HMrSV5細胞FN1和LAMC1蛋白及mRNA表達。表明半夏瀉心湯含藥血清可通過調(diào)節(jié)胃癌來源外泌體誘導的腹膜間皮細胞FN1和LAMC1表達，保護腹膜間皮細胞，增強腹膜間皮細胞對腫瘤細胞的抵御，防止胃癌細胞與腹膜間皮細胞黏附及向腹膜侵襲，這可能是半夏瀉心湯治療胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的作用機制之一。