園藝植物組織培養中的褐化現象及抗褐化研究進展

丁旭鋒 張談捷

摘 要：褐化是指植物組織培養中常見的細胞生長不良情況，已成為近年來植物組織培養的科研熱點之一。文章主要針對我國國內最新研究進展，闡明了細胞褐化現狀及其主要機制與產生原因，提出了抑制褐變的有效對策，以供參考。

關鍵詞：植物組織培養；褐化現象；抗褐化研究

文章編號：1005-2690（2023）15-0099-03 ? ? ? 中國圖書分類號：S60 ? ? ? 文獻標志碼：B

目前，在一些組織培養中常出現細胞褐變現象。褐變主要出現在細胞外植體中，也出現在愈傷細胞亞代、懸浮細胞以及原生質體培養中。褐變物質不但使周圍的植物、細胞、培養基等均轉為棕色，同時抑制多種蛋白質，影響培養基正常發育與分化，嚴重時可致死。因此，探討在植物組織培養工藝中的褐變問題、機制和預防措施，對目前工廠制劑中的植物研究以及植物外組織、原生質體、懸浮菌等培養具有重要的現實意義。

褐變可分為酶促褐變和非酶促褐變，一般認為主要是由酶促褐變而引起的。酶促褐變依靠蛋白酶、接收器和氧氣3種物質。構成褐變主要是蛋白質，即多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD），其中PPO是最重要的。褐變是一般正常組織細胞內多酚氧化酶活動的主要產物，其通過氧化酚類化合物而產生褐色覺醒物質。產生褐變的酶大多是酚類化合物。在一般正常的組織細胞內，化學物質、氧氣等和PPO的結合不能導致褐變。這主要是因為在一般組織細胞中，多酚主要分布于液泡中，其底物廣泛分布于各種質體及細胞漿中。這些區域的分布阻礙了底物和多酚接觸，給酶在細菌細胞壁結構發生變化或破壞時到達底物提供了必要條件。在有氧氣的情形下，酚類首先被氧化喚醒，再經過脫水處理和聚合過程，最后產生一種導致褐變的深褐色化合物，并由此導致了褐變。

1 褐化現象產生的原因

1.1 非酶促褐變

非酶促褐變是指由于應激障礙或其他不利條件引起的程序性凋亡，或由于壞死引起的細胞褐變，包括酚類化合物的形成。程序性凋亡可能由多種不利因素引起。采取適當措施或愈傷組織適應應激條件，這些細胞的褐變消失。

1.2 酶促褐變

酶促褐變是指由苯酚蛋白酶所催化醌類化合物的聚合物在高氧環境下產生的反應進程。一般植物細胞和培養體的褐色由某些植物的酚類化合物和多酚氧化酶大量產生，特別是木質植物中。一般在成熟的植株細胞內，因為酚類化合物和多酚氧化酶大量單獨產生，色素比較穩定。

在切除過程中，周圍結構的完整性遭到了嚴重破壞，同時酚類化合物與多酚氧化酶之間的隔離也受到了損傷，導致大量酚類化合物和多酚氧化酶排出。

另外，多酚氧化酶還將大部分酚類化合物氧化成了土壤棕醌和水。喹諾酮類藥物在酪氨酸蛋白酶等蛋白酶的影響下，和外源植物蛋白聚合，引起生長發育停止，最后引起細胞凋亡。

在正常的細胞中，其受底物、氧和PPO的產生均不會引起細菌褐變。這是因為在發育正常的組織細胞中，多酚彌散在正常細菌的液泡中，而PPO則彌散在各種質體的正常細菌胞漿中。這種不同的物理化學分區造成了襯底物與PPO的不相似。當細菌表皮層的物理化學性質被干擾或損傷之后，為酶體與PPO接觸創造了條件。在氧氣存在的前提下，酚類化合物就會被氧化成醌類，并和醌類產生了一系列脫水的聚合反應，也就隨之產生了暗棕色化合物，最后導致細胞褐變。

2 影響褐變的因素

2.1 物種及其基因型

草本植物通常較木本植物不易褐變，因為草本植物通常具有較低濃度的單寧或色素，而酚糖苷為產生木質素、單寧和色素的前體，使草本植物不易褐變。例如，浙江楠中的單寧含量愈高，組織培養就愈難，甚至形成的愈傷組織細胞也易褐變致死。萬壽菊的不同種子會有不同程度的褐變。所以在莖尖上培養的植物褐變程度會因種類而異。類似結果也發生在萬壽菊及其他園藝作物上。細胞色素含量較高的植物在組織培養中更易引起褐變。

褐變的深度和次數會因植株內酚類化合物濃度和酵素活力的差異而不同。木本植物的酚類化合物濃度大于草本植物。在組織培養過程中發現，草本植物的褐變率較低，而同一株植物不同品種、不同種類的植株褐變率也不同，如浙江楠的莖段易褐變。在實際研究中，雜交育種后的莖段往往只出現較輕度的褐變，而植株的繁殖和外植體上部分也會褐變，這是在育種過程中發生錯誤的重要因素。

2.2 外植體生理狀態

一般褐變隨年齡和組織木質化程度的增加而增加，例如在萬壽菊培養中，幼體外植體中醌含量低，而成體外植體中醌含量高。研究人員對24種菊花進行莖尖培養發現，冬春兩季的褐變死亡率較低，但其他季節的褐變死亡率較高。外植體大小會影響褐變，外植體的衰老程度愈高則外植體木質素濃度也愈高，更易產生褐變現象，而成體材料的褐變往往較雛體材料更為顯著。故有的研究者把萬壽菊苗的莖尖切開，接種后褐變程度較輕。但隨著苗齡增加，褐變現象逐步加劇，尤其成熟樹莖尖褐變現象更為嚴重。外植體的大小主要反映外植體的褐變，小的外植體容易褐變，而大的外植體不容易褐變。一些小萬壽菊品種的試驗證明，莖尖5～l0 mm的效果較好。同時，狹縫體積越大，氧化中的多酚越多，褐化效應越強。因此，外植體的機械破壞過程對褐化的形成也有很大影響，并且隨著機械損傷程度的增加而增加。在浙江楠葉片誘導過程中，整批葉片的褐變率低于多片葉片的褐變率。除了機械損傷外，所有用于殺菌的生物制劑也會導致外植體變黃。酒精殺菌對外植體的損傷更大，容易導致物種滅絕。不容易發生褐變的生物體，用氯化汞殺菌后通常不發生褐變，但用次氯酸鈉殺菌就容易發生褐變，而且殺菌效率遠低于次氯化汞[1]。

2.3 培養條件

從野外暴露在自然光下的植物中提取的萬壽菊尖端接種后會變黃。例如，在切割外植體之前的遮陽或分叉有助于減輕褐變，但由于在酚類化合物的合成與氧化過程中，酶系統的部分活力也是由光誘導的。另外，光在組織培養過程中促使酚類產物氧化。而光照條件對菊花葉片分泌的影響，主要有黑暗、漫射光、短晝和長晝。所以，在暗或弱的光照下栽培一段時間有助于降低植株的褐變率。

初級育種品種接種后在黑暗環境中培養，對褐變有一定的控制作用，但效果遠不如接種前的預處理。褐化的原理是整個氧化過程由酶系統控制，酶系統的活性也受光的影響。但必須注意的是，長期的暗培養會降低外植體的活力，甚至引起細胞凋亡，但是正確的時機還有待檢驗。

溫度對褐變的影響較大，15～25 ℃溫度環境培養比25 ℃以上培養的褐變較輕。據相關研究，在15～25 ℃溫度環境培育的萬壽菊的褐變比25 ℃以上培育的要低。在7 ℃溫度下培育景寧榕皮尖的褐變比15 ℃和30 ℃溫度下的低，這說明高溫能夠促進酚型的氧化，而低溫能夠控制酚型受質氧化。多酚氧化酶活力下降，產生了輕度堿褐變。2016年王明華教授等也證實了低溫環境對褐變嚴重的菊科種類有控制褐變的效果。

2.4 培養基及培養方式

培養基內糖的絲氨酸含量過多會導致細胞褐變。但在同樣含量下，蔗糖對褐變的抑制作用高于葡萄糖。礦物質成分影響褐變。在蝴蝶蘭的1代中，若培養基中Fe3＋和Cu2＋的含量越高，則褐變就越明顯，即Fe3＋和Cu2＋都能作為催化劑促進多酚和單線態氧（ROS）反應，從而被氧化成醌類。在萬壽菊愈傷組培養基上，由于氮源的配比錯誤可能會導致細胞褐變。在由萬壽菊愈傷細胞所誘導的繼代種培育工程中，培養基pH值改變可以導致酚類和酚氧化酶結合部位的改變，進而降低多酚的抗氧化能力。因此，隨著6-BA濃度增加，萬壽菊培養中腋芽外植體的褐變和死亡數量會增加。在培養基中加入抗氧化物質可以有效減少褐變，如在浙江楠愈傷組織培養基中添加抗壞血酸250 mg/L、亞硫酸鈉250 mg/L、檸檬酸5 000 mg/L，可以有效降低褐變；如果將1/2的配合物質添加到帶芽槭芽增殖培養基中，可以有效降低污染度和褐變。在蝴蝶蘭無菌苗培養基中加入200 mg/L的谷胱甘肽，對蝴蝶蘭植株的分化生長和控制褐變均有較好的綜合作用；而Vc和硫代硫酸鈉對褐變有較強的抑制作用，并且可控制外植物的生長發育與分化；高活性碳材料對控制褐變有很強的綜合作用，并對植物分化生長也有一定的抑制作用[2]。

不同的培養方式產生不同程度的褐變。增加愈傷細胞和培養基接觸上的給氧能力可以控制褐變，降低產生多酚的外植材料周圍的多酚也可以降低褐變率。針對不同的種類，可以控制褐變的培養基方式不同。因此用濾紙或在珍珠巖基質培育萬壽菊的效果良好；浙江楠的液體培養基有助于降低外植體的褐變。在萬壽菊培育上，將燒瓶旋轉10～15 d并更換新鮮培養基，可以顯著降低褐變率。在桑椹培養中，轉移期15 d時褐變率為9％，轉移期30 d時褐變率為64％。

3 防止褐變的措施

3.1 選擇適宜的培養基

一是調整介質中無機離子的種類和濃度。改性誘導培養基中，未改性誘導培養基效果較好，降低了Browning死亡率。使用改良的介質可以減輕褐變現象。二是改變了培養基內激素的含量與水平。外源融激素在較低濃度時可降低或引起褐變性。在培養基中加入抗氧化劑，常用的有抗壞血酸、硫代硫酸鈉、人血白蛋白等。培育工程中，在培養基中加入抗壞血酸可以有效防止細胞污染。在萬壽菊組織培養中加入抗氧化劑可以有效防止萬壽菊褐變。三是在介質中加入吸附劑。對于酚氧化物的吸收必須選擇較低濃度的活性炭，由于活化炭吸附力較強，所以活性炭材料更易于吸收酚氧化物。由于對活性碳材料的吸收沒有選擇性，多酚氧化物的營養物質能被迅速吸收。因此，在蝴蝶蘭的組織培養中，活化碳可以控制蝴蝶蘭生長發育，但不能將其分離。在組織培養中存在水解多酚，在這種外植體的培養中，多酚會釋放，并在培養基中逐漸變暗，且氧化成醌。多酚和醌之類的化合物控制酶的活力，因而可以控制從外植體中吸收的養分[3]。

3.2 選擇合適的外植體

大量科學研究證實，選用適宜的外植體和栽培條件是克服褐變的主要方法。外植體上必須具有強大的分生組織功能。在良好的細胞再分化和再分化環境下，外植體增殖旺盛，因此也大大減少了褐變。而在適宜的高溫和全黑暗環境下，外植體的褐變可明顯減少。經研究，外植體的酚氧化在暗培養或150 lx射線強度下被抑制，如在初始芽培養7～42 d，對于易發生褐變的材料，接種后旋轉時間過長、創面周圍醌類增多，會加劇材料的褐變[4]。

3.3 加入抗褐化劑、吸附劑

抗氧化劑與其他抑制劑除了可以有效控制酶促褐變Vc外，同樣是一種多氫氧基的還原產物。一方面，可以滅活多酚氧化酶，控制多酚物質氧化過程。另一方面，Vc在酶的催化下可以消耗大量溶解氧，使多酚化合物不會由于缺氧而氧化。在培養基中添加Vc能夠有效避免褐變。因此抗氧化劑的品種與含量對于防止銀杏褐變起關鍵作用。同時，通過活性炭吸附物和Vc的組合，能夠有效預防除香蕉莖尖以外植株其余部分的褐變。在繼代培養基中加入Vc 0.2 mg/L也能有效降低愈傷組織褐變率。

常見的吸收物質是活性碳塑料和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。其中，活性碳塑料是一種吸附性較好的無機吸附劑，能夠吸收培養基內的有害物質，如瓊脂培養基內的蛋白質、培養體分泌的酚型、蔗糖中經高溫消毒的醌類和五-羥甲基糠醛等，并促進培養體正常繁殖。在實際的應用環境中，要注意使用最低濃度的活性碳，以抵抗土壤褐變的風險，因為對活性碳的吸收沒有選擇性，在吸附物質的同時，也會吸收介質中的某些物質，對誘導外植物的細胞分化也有一定影響。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是一類獨特的酚型活性碳吸附劑，是生物化工的研究中酚類化合物和細胞器分開的保護物，是一種針對酚類化合物的專用吸附物。結果顯示，PVP對牡丹花莖中離體心肌細胞所產生的細胞內褐變有很強的抑制作用，而且隨著含量提高，抑制作用更加突出。但是一些試驗也表明，PVP并沒有完全防止褐變，因為植株中存在不同的酚類化合物，所以PVP也會有不同的分子數目類型[5]。

4 結束語

目前，我國對多酚類化合物在活細胞內生物動態代謝機制及其對蛋白質組成影響等方面的應用研究較少。因此，促使人們確定并研究引起褐變的多酚類型，研究其對細胞有害的生物機制，從根本上找到合理的解決方案，形成一個完整的體系。

參考文獻：

[1]林英，司春燦，賴遠東，等.納米材料對植物組織培養的影響及在植物組織培養上的應用[J].景德鎮學院學報，2022，37（6）：40-42，61.

[2]吳港圓，楊雅鈞，何石燕，等.植物組織培養技術研究進展[J].壯瑤藥研究，2022（1）：74-79，238-239.

[3]張梅，楊燕，盛鵬，等.植物組織培養中褐化現象控制方法分析[J].種子科技，2022，40（3）：91-93.

[4]張瑋雨.植物組織培養褐化現象研究進展及防治方法[J].農村經濟與科技，2017，28（14）：38.

[5]曾鐳，劉燕.植物組織培養中褐化問題的研究進展[J].安徽農學通報，2007，13（14）：49-50，152.