通過I.variabilis-EPSPS?基因轉(zhuǎn)育培育抗草甘膦油菜研究

柳寒

摘 要：本研究利用已有的I. variabilis-EPSPS*轉(zhuǎn)基因油菜資源，以優(yōu)良油菜品種浙油51和早熟高油品系B57為輪回親本，通過回交轉(zhuǎn)育的方式將I. variabilis-EPSPS*基因分別導(dǎo)入浙油51和B57中，并對F1群體和獲得的BC2F2群體進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入I. variabilis-EPSPS*基因后，植株對草甘膦均具有一定程度的抗性，其中以B57作為輪回親本回交轉(zhuǎn)育群體抗性表現(xiàn)更好，此研究為培育新型抗草甘膦油菜品種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：油菜；I. variabilis-EPSPS*；抗草甘膦

文章編號：1005-2690（2023）15-0001-03 ? ? ? 中國圖書分類號：S565.4 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

油菜是我國重要的油料作物，是世界五大食用油源之一。2021年，我國油菜播種面積超667萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)1 471.35萬t，平均產(chǎn)量不足2 250 kg/hm2。油菜田草害是限制油菜產(chǎn)量的重要因素，會造成常年減產(chǎn)10％～15％，嚴(yán)重時達(dá)到20％[1]。

傳統(tǒng)栽培模式中人工除草不僅耗費勞力，還會增加種植成本。施用選擇性除草劑雖能達(dá)到一定效果，但由于油菜田中雜草種類繁多，往往難以達(dá)到理想效果。因而培育和推廣廣譜性抗除草劑油菜品種十分必要，不僅可以降低除草成本，還能增加產(chǎn)量和總體效益。

草甘膦是目前應(yīng)用最廣泛的廣譜性除草劑之一，其作用靶標(biāo)為莽草酸路徑中的關(guān)鍵酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS），具有除草效果好、殘留量低、安全性高等優(yōu)點。隨著對epsps基因應(yīng)用系統(tǒng)的不斷研究，一系列轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜新品種應(yīng)運而生，并在多國取得了商業(yè)生產(chǎn)證書。這些品種的推廣將會嚴(yán)重影響我國油菜在國際油菜市場中的地位。

非敏感EPSPS合酶基因I. variabilis-EPSPS*是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)從放線菌屬變異居白蟻菌中克隆到的草甘膦抗性基因[2]。該基因編碼的蛋白不具有CP4-EPSPS專利保護的4條保守序列，但保留了對草甘膦較高的耐受性[3]。利用I. variabilis-EPSPS*基因創(chuàng)制的水稻轉(zhuǎn)化體可以耐受8 400 g/hm2高劑量的草甘膦，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[4]。

本研究利用已有的I. variabilis-EPSPS*轉(zhuǎn)基因油菜資源，利用回交轉(zhuǎn)育的方式將I. variabilis-EPSPS*基因?qū)雰?yōu)良的油菜新品種或者新品系中，培育新型的抗草甘膦油菜品種，期望為我國油菜田的雜草治理提供新的解決方案。

1 材料和方法

1.1 試驗方法和技術(shù)路線

本試驗技術(shù)路線如圖1所示。其中，甲HX6由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將改造載體pCAMBIA1300-I. variabilis-EPSPS?導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜受體甲9707中獲得。所用的載體攜帶1.3 kb的I. variabilis-EPSPS?目的基因表達(dá)盒，其5端連有228 bp的葉綠體定位信號肽（CTP）和100 bp的UTR序列。

本研究以甲HX6為父本，與浙油51和早熟高油品系B57雜交獲得F1后，以浙油51和B57作為輪回親本回交2代后再自交1代，分別獲得耐除草劑轉(zhuǎn)基因油菜新材料GR51和GR57。浙油51（國審油2013017），連續(xù)多年被列為浙江省油菜主導(dǎo)品種；B57是近年來篩選出的早熟高油品系，含油量超過50％，其生長情況如圖2所示（同一時期播種）。

1.2 抗除草劑植株檢測

待植株生長至4～5葉期時，取單株幼嫩葉片，利用CTAB法提取葉片DNA，利用I.variabilis-EPSPS?基因特異引物（PP1：CTCAGGGCTCTTGGCGCTGAG

AT；PP2：TGCAATGGCCTCGGGGTGATAAC）進(jìn)行PCR擴增，擴增片段長度971 bp。

1.3 抗性鑒定

溫室抗性鑒定：將41％草甘膦異丙胺鹽分別稀釋100、200、300倍，用噴壺均勻噴灑，每個濃度為3次重復(fù)，噴施7 d和14 d后觀察結(jié)果。

田間抗性鑒定：5～6葉期進(jìn)行除草劑噴施試驗。設(shè)3個噴施濃度，分別為中量（41％草甘膦異丙胺鹽2 250 mL/hm2，大約稀釋200倍，0.5％濃度）、中量的2倍量（41％草甘膦異丙胺鹽4 500 mL/hm2，大約稀釋100倍，1％濃度）、中量的4倍量（41％草甘膦異丙胺鹽9 000 mL/hm2，大約稀釋50倍，2％濃度），每個濃度3次重復(fù)，分別設(shè)置對照，噴施10 d后觀察植株生長情況。

2 結(jié)果

2.1 親本種植及F1種子的獲得

將抗除草劑轉(zhuǎn)基因株系甲HX6與浙油51和B57分別播在玻璃溫室中。待開花初期對甲HX6套袋，防止花粉外散。

做雜交時，取甲HX6花粉涂抹到浙油51和B57去雄花器官柱頭上。待柱頭膨大雜交成功后，立即拔除甲HX6轉(zhuǎn)基因植株。最終獲得2份F1材料，分別為51 F1和57 F1。

2.2 F1種植、溫室抗性鑒定及BC1F1種子的獲得

將51 F1和57 F1播于50孔穴盆中，置于玻璃溫室中。待生長至5～6葉期時，噴施不同濃度的除草劑（農(nóng)達(dá)41％異丙胺鹽制劑），以親本B57為對照（CK），觀察比較抗性情況，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，對照CK噴施除草劑7 d后生長明顯受到抑制，51 F1和57 F1均表現(xiàn)出一定的抗性。14 d后，對照（CK）全部枯萎死亡，51 F1和57 F1雖葉片出現(xiàn)黃化，但仍存活，同時57 F1總體生長情況好于51 F1。選擇生長態(tài)勢良好的51 F1和57 F1各6株種植于溫室中，開花初期套袋。有足夠花粉時取花粉涂抹到浙油51和B57去雄花器官柱頭上。待柱頭膨大雜交成功后立即拔除51 F1和57 F1植株。最終獲得2份BC1F1材料，分別為51 BC1F1和57 BC1F1。

2.3 BC1F1單株抗除草劑基因檢測及BC2F1的獲得

將51 BC1F1和57 BC1F1分別播于50孔穴盆中。待生長至4～5葉期時，取單株幼嫩葉片提取DNA，利用I.variabilis-EPSPS?基因特異引物分別對51 BC1F1和57 BC1F1的各個單株進(jìn)行檢測，獲得含有目標(biāo)抗性基因的植株21株和14株。BC1F1單株抗性基因檢測結(jié)果如圖4所示。分別移栽10株BC1F1種植在玻璃溫室中，與浙油51和B57再進(jìn)行1次回交，獲得BC2F1種子。

2.4 BC2F2的獲得

將51 BC2F1和57 BC2F1分別播于50孔穴盆中，每孔1粒種子。長大后取葉片提取DNA進(jìn)行抗除草劑基因檢測，保留有條帶的單株移栽于溫室中，待開花期去頂套袋自交，只保留套袋花絮，其余花絮全部打掉。收自交種51 BC2F2和57 BC2F2。

2.5 BC2F2農(nóng)達(dá)噴施試驗及篩選

將51 BC2F2和57 BC2F2種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊渡轉(zhuǎn)基因基地，5～6葉期進(jìn)行除草劑噴施

試驗，由于天氣原因，錯過了最佳噴藥時期。抽薹期進(jìn)行除草劑噴施試驗。按照中量、中量的2倍量和中量的4倍量進(jìn)行噴施，每個濃度3次重復(fù)，分別以浙油51 和B57作為對照進(jìn)行抗性比較。

噴施10 d后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)育的含I.variabilis-EPSPS?基因的植株抗性明顯，尤其是B57作為親本轉(zhuǎn)育的抗性材料，即使是中量的4倍量噴施，藥害也不是很明顯。作為對照的2個受體親本浙油51和B57均葉片發(fā)黃，最大濃度處理的植株葉片已經(jīng)開始枯萎。總體來看，2個轉(zhuǎn)育材料均表現(xiàn)出較強的抗性，表現(xiàn)良好。中量的2倍量噴施結(jié)果如圖5所示。

3 結(jié)論與建議

本研究以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的I. variabilis-EPSPS*轉(zhuǎn)基因抗草甘膦油菜甲HX6作為父本，與浙油51和早熟高油品系B57雜交獲得F1后，以浙油51和B57作為輪回親本進(jìn)行連續(xù)回交后再自交進(jìn)行篩選，以期獲得具有草甘膦抗性的新材料。

目前，回交轉(zhuǎn)育工作已進(jìn)行至BC3代，獲得了BC2F2代群體。在對BC2F2群體的抗性鑒定和篩選中發(fā)現(xiàn)，受體親本不同，其抗性會存在較大差異。B57背景轉(zhuǎn)育材料抗性略優(yōu)于浙油51背景轉(zhuǎn)育材料。未轉(zhuǎn)育的受體親本對照對草甘膦的反應(yīng)也存在差異，浙油51較B57敏感，噴施后癥狀表現(xiàn)更快、更明顯。草甘膦又名N-（磷酸甲基）甘氨酸，是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型有機磷類除草劑，推測不同受體間對于草甘膦的敏感性差異很可能與不同材料間的磷利用效率有關(guān)。

經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部備案，有2份材料（編號分別為GR51和GR57）已經(jīng)進(jìn)入中間試驗階段，后續(xù)將按照中間試驗規(guī)劃對上述2個材料進(jìn)行評價，開展轉(zhuǎn)基因耐除草劑油菜GR51和GR57對靶標(biāo)除草劑草甘膦的耐受性試驗和對田間常用的其他除草劑（非靶標(biāo)）的影響等內(nèi)容，同時考察目標(biāo)性狀在不同世代之間的遺傳穩(wěn)定性、生存競爭能力及農(nóng)藝性狀等。

參考文獻(xiàn)：

[1]俞琦英，周偉軍.油菜田的雜草發(fā)生特點及其防治研究概況[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：123-127.

[2]劉子鐸，易沭遠(yuǎn)，林擁軍，等.一種分離的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因[P].CN103834674，2016-03-23.

[3]Yi SY， Wu GB， Lin YJ， et al. Characterization of a new type of glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Isoptericola variabilis[J].Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic， 2015，111：1-8.

[4] Cui Y， Huang SQ， Liu ZD， et al. Development of novel glyphosate-tolerant japonica rice lines： A step toward commercial release[J]. Frontiers in Plant Science， 2016（7）：1218.