不同固定劑對鼻息肉上皮細胞免疫熒光染色的影響

李 穎 矯 健 張 羅*

(1. 首都醫科大學附屬北京同仁醫院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100730; 2. 北京市耳鼻咽喉科研究所 耳鼻咽喉頭頸科學教育部重點實驗室(首都醫科大學)，鼻病研究北京市重點實驗室，北京 100005)

鼻息肉是多種致病因素作用下鼻黏膜的慢性持續性炎性反應。近年來，對其發病機制的研究不斷深入。體外培養細胞免疫熒光染色作為基本技術手段普遍應用于研究中，對于不同的標記蛋白，固定劑的選擇對染色結果起著至關重要的作用。為探討不同固定劑對不同標記蛋白免疫熒光染色結果的影響，筆者選擇了3種細胞染色中常用的固定劑及4種研究中用到的不同結合部位的標記蛋白，應用于此研究中。為在鼻息肉發病機制的研究中，細胞免疫熒光染色最佳固定劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織細胞培養

無菌條件下取鼻息肉組織, 浸泡于含有雙抗的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液中, 浸泡并沖洗3 遍,置于0.1%(質量分數)蛋白酶(美國Sigma公司)中，4 ℃過夜后5%(體積分數) FBS終止消化，離心收集上皮細胞，以2.5×105/mL密度接種于四孔培養板中蓋玻片上，加入培養液，37 ℃ 5%(體積分數)CO2培養箱中培養，每2～3 d換液1次。第七天終止培養。

1.1.2 主要試劑及儀器

兔多克隆抗緊密連接蛋白(zonular occludens-1，ZO-1)抗體購自美國Invitrogen公司；鼠單克隆抗β-微管蛋白(tubulin)抗體購自美國Sigma公司；兔多克隆抗跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)抗體, 兔多克隆抗組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases1,HDAC1)抗體購自美國Abcam公司； 羅丹明標記羊抗鼠IgG，羅丹明標記羊抗兔 IgG購自美國Merck公司；含DAPI熒光封片劑購自美國abcam公司等。IX81激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

將培養好的細胞分為1、2、3、4四組，每組為6個細胞爬片，棄掉培養液，用PBS洗一遍，每組分別用4%(質量分數)多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)、等體積甲醇丙酮及甲醇3種固定劑固定(每種固定劑固定兩張細胞爬片)，室溫固定10 min，分別用PBS洗3遍，1%(體積分數)Triton X-100透膜10 min，PBS洗3遍，封閉用山羊血清封閉非特異性染色20 min，第1組滴加一抗ZO-1 1∶100、第2組滴加一抗β-tubulin 1∶500、 第3組滴加一抗TMEM16A 1∶100、 第4組滴加一抗HDAC1 1∶100，4 ℃孵育過夜，PBS洗3遍，分別滴加羅丹明標記羊抗鼠IgG 1∶100，或羅丹明標記羊抗兔IgG 1∶100相應熒光二抗，室溫避光孵育1.5 h，PBS洗3遍，含DAPI封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、照相。

1.3 實驗結果判定方法

同一標記蛋白在掃描參數相同的情況下，將圖像調至相對最清晰時進行40倍掃描獲取圖像。結合圖像的熒光強度及抗體結合的特異程度，對結果進行判定。

2 結果

2.1 第1組(ZO-1組)染色結果

4%(質量分數)PFA固定的細胞ZO-1在細胞密集區的細胞緊密連接處呈陽性表達，但染色不清晰，且有細胞質非特異性背景染色。等體積甲醇丙酮混合液和甲醇固定的細胞ZO-1細胞密集區細胞緊密連接處呈陽性表達，且染色清晰，幾乎無細胞質非特異性背景染色(圖1)。

圖1 免疫熒光染色3種不同固定劑固定的ZO-1染色結果

2.2 第2組(β-tubulin組)染色結果

4%(質量分數)PFA、等體積甲醇丙酮混合液及甲醇固定的細胞β-tubulin骨架蛋白染色均層次清晰，微絲結構完整，立體感較強，無非特異性背景染色，尤以甲醇固定的結果更為突出(圖2)。

2.3 第3組(TMEM16A組)染色結果

4%(質量分數)PFA固定的細胞TMEM16A幾乎無特異性染色。等體積甲醇丙酮混合液及甲醇固定的細胞細胞膜及細胞質蛋白陽性表達清晰明顯，背景清晰(圖3)。

2.4 第4組(HDAC1組)染色結果

4%(質量分數)PFA、等體積甲醇丙酮混合液及甲醇固定的細胞HDAC1細胞核陽性均染色較強，核質清晰，無非特異性背景染色(圖4)。

圖2 免疫熒光染色3種不同固定劑固定的β-tubulin染色結果

圖3 免疫熒光染色3種不同固定劑固定的TMEM16A染色結果

圖4 免疫熒光染色3種不同固定劑固定的HDAC1染色結果

3 討論

免疫熒光染色中固定的目的是迅速終止酶的活性，避免組織細胞結構的解體，將抗原穩定固定在原位，并保持其抗原性。良好的固定劑應能保持細胞及亞細胞結構的真實性，并使抗體大分子進入細胞內與抗原結合[1]。一般生物學實驗室常用的固定劑分為兩大類：有機溶劑和交聯劑[2]。有機溶劑如丙酮及醇類等，其作用是沉淀蛋白質和糖，對組織穿透性很強，保存抗原的免疫活性較好。交聯劑如PFA，其作用是使組織之間相互交聯，保存抗原于原位，其優點是組織穿透性強，收縮性小[3]。在日常免疫熒光染色實驗中筆者發現，不同的固定劑對實驗結果起著至關重要的作用，有時還會產生不同的結果。為驗證固定劑對免疫熒光染色結果的影響和為今后的實驗提供實驗基礎，選用了細胞染色中較常用的4%(質量分數)PFA、等體積甲醇丙酮混合液及甲醇3種固定劑，應用于本研究中。為了保證實驗結果的可比性，筆者經反復實驗，將4種標記蛋白的實驗條件進行優化，確定出除固定劑外的最佳實驗條件，用優化后的實驗條件對固定后的細胞進行染色，觀察3種固定劑對不同標記蛋白的固定效果。

微管蛋白屬細胞骨架蛋白，是細胞骨架纖維中最粗的一種,分為3大類α-tubulin、β-tubulin 和γ-tubulin[4]。其中β-tubulin常被用于免疫染色觀察細胞的微管結構[5]。微管不僅與細胞形態密切相關, 而且參與細胞的運動、物質轉運、信息傳遞以及細胞分裂、分化、基因表達等多種功能。因此β-tubulin 正常排列的破壞及表達異常與纖毛的功能異常、細胞損傷等密切相關。有機溶劑固定劑在去除脂質使細胞脫水的同時，使蛋白質瞬間沉淀在細胞骨架上。作為一種胞外的細胞骨架蛋白，3種固定劑均取得較好的固定效果，尤其是甲醇固定的β-tubulin染色極其清晰。

上皮的屏障功能依賴于上皮細胞的完整性和細胞間相連接的連接復合體，其中起決定性作用的是緊密連接[6]。緊密連接的屏障功能受不同外源性刺激的動態調節，與人類健康和對疾病的易感性密切相關[7]。緊密連接功能失調、細胞間通透性增高，炎性反應介質進入，激發黏膜免疫系統，導致炎性反應和組織損傷。緊密連接位于細胞與細胞之間連接的最頂端，由緊密連接相關蛋白組成。ZO-1是最具特征的胞質緊密連接蛋白[8]。4%(質量分數)PFA作為一種能較好保護抗原結構的固定劑，廣泛應用于細胞免疫組織化學染色中，但由于它的作用溫和可能會損失某些細胞成分的抗原性。雖然筆者在實驗中增加了打孔透膜步驟，但ZO-1的染色結果還是不夠理想。而等體積甲醇丙酮混合液及甲醇的固定效果都很好，緊密連接染色清晰銳利。

TMEM16A屬于具有多次跨膜結構的蛋白質家族——TMEM16 家族。2008年，3個獨立的研究小組分別從不同角度驗證鈣激活氯離子通道 (calcium-activated chloridechannels，CaCCs)的1個分子身份為TMEM16A[9]。眾所周知， CaCCs 最重要的功能之一是在上皮細胞中為氯離子的分泌提供路徑。在許多上皮組織中，都觀察到TMEM16A的高表達，包括呼吸道上皮[10]、唾液腺[11]、胰腺導管細胞[12]和腸道上皮細胞[13]。因而，對于TMEM16A在上皮細胞液體分泌過程中作用的研究十分重要。TMEM16A表達于胞膜和胞質中，除4%(質量分數)PFA固定細胞未見陽性表達外，其余兩種固定劑固定的細胞均見較好的胞膜及胞質陽性表達。

HDAC1是哺乳動物的第一個組蛋白去乙酰化酶，在組蛋白乙酰化水平的調控過程中發揮重要作用[14]。HDAC1蛋白由482個氨基酸組成,相對分子質量為55 000, HDAC1蛋白能夠降低組蛋白的乙酰化水平, 促使染色體形成一個超螺旋結構, 抑制機體內正常基因的表達, 促進腫瘤的生長, 主要存在于細胞核內, 能夠調控細胞的生長[15]。近年來也應用于鼻息肉的研究中。作為一種胞核蛋白，3種固定劑均取得了較好的固定效果。

綜上所述，等體積甲醇丙酮混合液及甲醇在骨架蛋白、細胞連接蛋白、細胞膜和細胞質蛋白、胞核蛋白的染色中均取得較好的固定效果，4%(質量分數)PFA對細胞連接蛋白和胞漿蛋白的固定效果不理想。一般來說，有機溶劑固定劑用于細胞骨架成分的固定，交聯劑固定劑用于膜相關成分的固定。但這并不是絕對的，本結果就與之不完全相同。因為不同抗原，其穩定性也不相同，因而對固定劑的耐受性差異較大[3]。而且每一種固定劑都有它的長處和短處，沒有一種固定劑適用于所有標記蛋白，必要時，可作多種固定劑對比，從而選出理想的固定方法。根據筆者的經驗，在細胞免疫熒光染色中要結合所要檢測抗原的結構特點和不同固定劑的特性，來對固定劑進行選擇。其次，抗體生產廠家的選擇、打孔步驟的添加、細胞的培養狀態等等均對實驗結果有著至關重要的影響。本實驗僅對鼻息肉發病機制研究中用到的幾種標記蛋白的固定劑選擇進行了探究，以期為此項研究的細胞免疫熒光染色實驗提供參考依據，奠定實驗基礎。