抗磷脂抗體與自然流產患者既往流產次數的相關性分析

陳聰，游曉玲，莫李芳，陳現，李龍飛，蔡松辰，曾勇，李玉葉

(深圳中山泌尿外科醫院生殖免疫實驗室,廣東省圍著床期生殖免疫工程技術研究中心,深圳 518043)

自然流產(spontaneous abortion,SA)是妊娠期最常見的一種并發癥,育齡期女性發生1次自然流產的概率為10%左右。我國將妊娠不足28周、胎兒體重不足1 000 g的妊娠中止定義為自然流產[1-2]。引起自然流產的因素復雜,主要包括自身免疫、凝血功能、遺傳、解剖、內分泌、感染、心理和環境異常等。隨著現代生殖免疫學的不斷發展,越來越多的研究表明,抗磷脂抗體(antiphospholipid antibodies,aPLs)與自然流產密切相關[3-4]。抗磷脂綜合癥(antiphosphoplipid syndrome,APS)是一類系統性自身免疫性疾病,其特征是aPLs持續陽性合并血栓形成和/或病理妊娠[5]。根據札幌標準悉尼修訂的分類標準[6],典型aPLs[包括狼瘡抗凝物(lupus anticoagulant,LA)、IgM/IgG型抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibodies,aCL)、IgM/IgG型抗β2糖蛋白1抗體(anti-β2 glycoprotein I antibodies,aβ2GPI)是APS的實驗室診斷指標。近年來的研究發現,非典型aPLs抗體[如抗磷脂酰絲氨酸/凝血酶原復合物抗體(anti-phosphatidylserine and prothrombin,aPS/PT)及抗膜聯蛋白A5抗體(anti-annexin A5 antibodies,aANXA5)等可能與不明原因的自然流產存在一定的相關性[7]。然而,國內外指南或專家共識對于自然流產患者篩查aPLs的類型、起始時間點并沒有完全統一。2011年英國皇家婦產科醫師協會(RCOG)認為,所有復發性早期流產的患者和有一次或多次中期妊娠流產的患者,都應在懷孕前進行aPLs篩查[6];但2018年低分子肝素防治自然流產中國專家共識、2020年自然流產診治中國專家共識以及2022年歐洲人類生殖與胚胎學學會(ESHRE)發布的反復自然流產(recurrent spontaneous abortion,RSA)診治指南認為,患者經歷2次妊娠丟失后就可以篩查相關典型的aPLs[2,8-9];另外,各指南對于非典型aPLs抗體的篩查價值和篩查時間點不明確。因此,開展評估典型和非典型aPLs抗體與既往流產次數的關系,將有利于進一步明確自然流產患者篩查aPLs的類型及時間點,為臨床治療策略提供可靠的實驗室依據。

材料與方法

一、研究對象

選擇2019年5月至2022年8月初次到深圳中山泌尿外科醫院生殖免疫中心接受診療的自然流產患者作為研究對象。所有患者詳細問詢既往病史、男女雙方染色體、宮腔鏡及內分泌檢查等。納入標準:(1)年齡20～45歲;(2)男女雙方染色體無異常;(3)女方無生殖系統感染、解剖結構無異常;(4)男方精液常規檢查正常;(5)無自身免疫疾病史及先天性血栓性疾病;(6)既往流產物絨毛染色體檢測無異常。

共納入878例患者,根據既往自然流產次數分為:1次自然流產組(S1組,n=478),2次自然流產組(S2組,n=292),3次自然流產組(S3組,n=73)以及≥4次自然流產組(S4組,n=35)。

本研究獲得本院學術與倫理學委員會批準許可,倫理批號:審批件(2023)醫倫快審第(010)號。所有患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.抗體檢測的血清收集:患者在初診當月抽取外周血,離心、吸取血清后,置于-80℃冰箱保存待用。

2.典型aPLs水平測定:采用化學發光儀(iFlash 3000)檢測血清中aCL-IgM(貨號:C89018M)、aCL-IgG(貨號:C89005G)和aβ2GPI-IgM(貨號:C89052M)、aβ2GPI-IgG(貨號:C89006G)抗體水平,所用配套試劑均采購于深圳亞輝龍公司。陽性判斷標準:aCL-IgM≥10 AU/ml、aCL-IgG≥6 AU/ml、aβ2GPI-IgM≥20 AU/ml、aβ2GPI-IgG≥6 AU/ml定義為陽性。

3.非典型aPLs水平測定:采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清中IgM/IgG型aPS/PT與 aANXA5水平。分別采用aPS/PT的IgM型、IgG型抗體檢測試劑盒(Inova,美國)及aANXA5的IgM型、IgG型抗體檢測試劑盒(Demeditec,德國) 檢測血清中對應的抗體。檢測過程如下:先將血清用樣本稀釋液以1∶101比例稀釋,在對應檢測微孔中分別加100 μl 5個不同濃度的標準品,1個陰性質控、1個陽性質控、1個空白孔、稀釋后的樣本,室溫(20～25℃)孵育30 min后洗板3次;向各微孔內分別加入100 μl酶標二抗,室溫孵育30 min后洗板3次;向各微孔內加入100 μl底物液,室溫避光孵育30 min后立即加入100 μl終止液,在波長450 nm處讀取吸光度(OD值),用回歸分析曲線圖分析各樣品濃度值。陽性判斷標準:aPS/PT-IgM≥30 U/mL、aPS/PT-IgG≥30 U/mL、aANXA5-IgM≥5 U/mL、aANXA5-IgG≥5 U/mL定義為陽性。

4.生殖激素水平測定:于月經周期第2～3天采集患者外周血,利用電化學發光儀(Cobas e601,Roche,瑞士)檢測血清卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、孕激素(P4)、黃體生成素(LH)水平。所用配套試劑盒均購于瑞士Roche公司。

三、統計學分析

結 果

一、一般資料比較

本研究共納入878例患者,根據既往自然流產次數不同分為1次自然流產組(S1組)、2次自然流產組(S2組)、3次自然流產組(S3組)以及≥4次自然流產組(S4組)。4組患者間年齡、體質量指數(BMI)和基礎激素(FSH、E2、P4、LH)水平進行比較,均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 四組患者一般資料比較[(-±s),M(P25,P75)]

二、各組患者血清中典型aPLs及其分型陽性率比較

典型抗磷脂抗體aβ2GPI(IgM+IgG)、aCL(IgM+IgG)及其分型(aβ2GPI-IgM、aβ2GPI-IgG、aCL-IgM、aCL-IgG)在4組患者血清中的陽性率比較均無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 四組患者血清中典型aPLs及其分型陽性率比較[n(%)]

三、各組患者血清中非典型抗磷脂抗體aPS/PT、aANXA5及其分型陽性率比較

將非典型抗磷脂抗體aPS/PT(IgM+IgG)、aANXA5(IgM+IgG)及其分型(aPS/PT-IgM、aPS/PT-IgG、aANXA5-IgM、aANXA5-IgG)在4組患者血清中的陽性率進行比較,結果發現aPS/PT(IgM+IgG)和aPS/PT-IgM陽性率在4組患者中具有顯著性差異(P<0.05);進一步兩兩比較后發現,S4組患者血清中的 aPS/PT(IgM+IgG)和aPS/PT-IgM陽性率顯著高于其他3組(P<0.05),而 S1、S2和S3組間的aPS/PT(IgM+IgG)和aPS/PT-IgM陽性率均無統計學差異(P>0.05)(表3)。

表3 四組患者血清中非典型抗磷脂抗體aPS/PT、aANXA5及其分型陽性率比較[n(%)]

討 論

本研究中針對接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療的自然流產患者,通過檢測血清中各類型典型與非典型aPLs陽性率,分析其與既往流產次數的相關關系。研究發現,典型抗磷脂抗體aβ2GPI、aCL和非典型抗磷脂抗體aANXA5及其IgM/IgG分型抗體陽性檢出率與既往自然流產次數無顯著相關關系;但非典型的抗磷脂抗體aPS/PT及其aPS/PT-IgM分型抗體在≥4次的自然流產次數患者中,陽性檢出率上升,與其他組別有顯著差異。

aPLs是一組以磷脂或磷脂結合蛋白為靶抗原的自身抗體的總稱,主要存在于APS患者中。aPLs主要包括IgM、IgG及IgA型,且以IgM型和IgG型為主。報道顯示,約26.4%的自然流產患者與aPLs陽性有關[10]。目前關于aPLs導致的流產原因尚未完全明確,可能的機制是:aPLs干擾滋養層細胞的融合、侵襲和增殖,直接損傷胎盤,影響子宮內膜螺旋動脈的重塑,導致胎盤功能障礙,血流減少或中斷,胎兒的血氧與營養物質供應減少,從而引起流產和胎兒生長受限等不良妊娠[11-12]。目前納入APS實驗室診斷標準的典型aPLs主要有:LA、aCL和aβ2GPI。隨著研究的進展,越來越多非典型aPLs,如aPS/PT及aANXA5,受到生殖免疫基礎和臨床研究學者的關注,但不同類型aPLs與既往自然流產次數間的關系研究并不多,而且國內外指南或專家共識對于流產患者篩查aPLs的類型及起始時間并沒有完全統一,特別對于非典型aPLs是否進行篩查更沒有達成共識[13]。因此,本研究檢測和分析了既往不同自然流產次數的患者血清中IgM/IgG型aCL、aβ2GPI、aPS/PT和aANXA5陽性率,以及與自然流產次數之間的相關關系,探討不同類型aPLs在自然流產患者的篩查價值及時間。

aβ2GPI和aCL作為典型aPLs,被國內外指南或專家共識中推薦用于篩查不明原因流產患者的重要指標[14],與復發性流產具有很強的相關關系,OR(95%CI)值分別為2.12(0.69,6.53)和5.61(1.26,25.03)[15]。aβ2GPI抗體被認為是自然流產和血栓癥特異的標志物[16-17]。aβ2GPI抗體通過結合滋養層細胞表達的β2GPI,減少人絨毛膜促性腺激素分泌和滋養層細胞侵襲,導致滋養層細胞侵襲功能受損,引發妊娠并發癥[18]。而aCL作為抗磷脂抗體的標志性抗體,同樣參與了妊娠并發癥,因此可導致蛻膜血管病變、子宮胎盤功能不全、胎盤血栓和梗死[19]。既往研究表明,aβ2GPI抗體和aCL抗體在反復自然流產組陽性率及抗體滴度均顯著高于正常對照組[20-21]。本研究分析aβ2GPI(IgM+IgG)和aCL(IgM+IgG)及其分型aβ2GPI-IgM、aβ2GPI-IgG、aCL-IgM、aCL-IgG抗體水平與自然流產患者既往流產次數之間的關系,發現并無明顯相關性,與中心前期研究的結果相似[22]。另外,Gonen等[23]的研究顯示,aCL與復發性流產的次數無關,說明aCL和aβ2GPI及其分型抗體陽性率可能并不與自然流產次數直接相關。但馬開慧和羅兆芹等[24-25]的研究發現,aCL陽性率隨著自然流產次數的增加而增加。這種不同研究結論的差異可能由檢測試劑與方法學間的差異所致。

輔助生殖臨床診療過程中常發現大量具有APS臨床表現、但血清學陰性的APS患者,亟需尋找和開發一些新的、具有臨床意義的非典型aPLs抗體,包括aPS/PT抗體和aANXA5抗體。

aPS/PT抗體是以磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)和凝血酶原(Prothrombin,PT)復合物為靶點的抗體。研究顯示,aPS/PT抗體與動靜脈血栓和產科并發癥具有高度相關性,IgG和IgM型aPS/PT抗體在血栓形成組(靜脈和/或動脈血栓形成)患者中比無血栓形成組的患者中更常見[26-27]。兩項回顧性研究發現,在血清學陰性的APS患者中,aPS/PT抗體陽性檢出率高達50%[28-29]。?igon等[30]研究證實,aPS/PT抗體與復發性早期自然流產、晚期流產、先兆子癇、胎盤功能不全早產等妊娠并發癥具有相關性。Pleguezuelo等[31]報道,aPS/PT抗體在流產2次組患者中陽性檢出率為16.6%,在流產3次組患者中檢出率為15.4%,均顯著高于正常對照組2.9%,提示aPS/PT抗體在流產患者的診斷中可能具有重要的參考意義。本研究分析了自然流產患者既往不同流產次數間aPS/PT(IgM+IgG)及其分型aPS/PT-IgM、aPS/PT-IgG抗體的陽性檢出率。結果顯示,自然流產次數≤3時,各組間的陽性檢出率并無統計學差異;但當自然流產次數≥4時,aPS/PT(IgM+IgG)和aPS/PT-IgM抗體陽性率顯著高于前3組患者,提示aPS/PT抗體在反復性自然流產(次數≥4)患者的診斷中具有潛在參考意義。臨床上可嘗試檢測aPS/PT抗體,并采取相應的干預措施,改善多次自然流產患者的臨床妊娠結局。

膜聯蛋白A5(Annexin V)是一種鈣依賴的磷脂結合蛋白,由血小板和胎盤滋養層細胞合成,廣泛存在于胎盤絨毛表面的頂端,具有很強的抗凝血特性,在母胎血液循環中起重要作用。Annexin V的血栓調節作用來自于它能夠在磷脂雙層膜上形成一個二維晶體抗血栓屏障,從而阻止凝血因子與磷脂表面結合[32]。aANXA5抗體首次在系統性紅斑狼瘡患者中檢測到,被認為是aPLs抗體的一個亞群[33]。研究顯示,aANXA5抗體與早期妊娠丟失、子癇前期等妊娠并發癥的發生有關[34]。aANXA5抗體與Annexin V競爭磷脂結合,導致抗血栓屏障層的缺失,從而加速血小板促凝活性,引發血栓和妊娠丟失[35-36]。Wang等[37]通過在妊娠的BALB/c小鼠體內輸注aANXA5抗體,可明顯觀察到該小鼠胎盤血栓形成和組織壞死,提示aANXA5抗體可能會導致胎盤Annexin V丟失,使母胎組織血栓形成,影響血液營養交換功能,進而導致妊娠丟失的原因。Sater等[38]研究發現,在復發性流產患者中,aANXA5抗體明顯高于多胎妊娠史的婦女,提示aANXA5抗體為復發性流產的獨立危險因素。Zhang等[39]在研究aANXA5抗體與APS臨床相關性的評價中發現,與健康人群相比,APS患者中的aANXA5抗體水平顯著升高,與動靜脈血栓事件顯著相關,但在有妊娠并發癥的患者和沒有妊娠并發癥的患者之間,aANXA5抗體水平無顯著差異。然而,本研究發現,aANXA5及其分型抗體陽性率與自然流產次數無相關性,其與不良妊娠結局的相關性有待進一步討論和分析。

由于本研究中所納入的受試者均為自然流產患者,缺乏健康對照組,加上自然流產≥4次的樣本量相對較少,后續仍需要加大樣本量來進一步闡明各種aPLs抗體,特別是非典型aPS/PT抗體與自然流產患者既往流產次數的相關關系和機制。

綜上所述,總aβ2GPI、aCL、aANXA5及其分型抗體陽性檢出率并不隨自然流產次數的增加而發生顯著變化,但aPS/PT及其分型aPS/PT-IgM抗體在自然流產次數≥4的患者中,陽性檢出率顯著升高,提示總aPS/PT或aPS/PT-IgM抗體在反復自然流產患者中具有潛在的風險提示作用,未來可作為評估自然流產風險的實驗室診斷補充指標。