基于代謝組學和特征分子網絡技術分析小鼠體內氧氟沙星的代謝產物

王建鳳，王澤昊，2，張藝楷，劉 艷*，馮月超*

（1．北京市科學技術研究院分析測試研究所（北京市理化分析測試中心），北京市食品安全分析測試工程技術研究中心，北京 100089；2．首都師范大學 化學系，北京 100048）

代謝組學利用高通量技術對生物體內代謝產物進行系統性分析。通過代謝組學研究，可以發現與疾病、環境、遺傳等因素有關的代謝物的變化規律和代謝途徑，從而為疾病的早期診斷和治療提供新的思路和方法。相關研究主要使用的技術包括質譜、核磁共振和色譜等［1］。質譜是目前最常用的技術，其中氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）、液相色譜-質譜聯用（LC-MS）技術應用最為廣泛［2］。目前代謝組學研究仍存在數據的豐富性和復雜性等挑戰，因此，需要不斷完善相應的研究技術和數據分析方法，進一步提高代謝組學研究的可信度和廣泛性。

分子網絡是基于串聯質譜數據的組織和可視化，根據相關化合物二級質譜碎片的相似性［3］，計算光譜相似度，揭示同源質譜片段的存在［4］。根據碎片相似度的高低，運用MS-聚類算法［5］可將質譜碎片圖整合為一種能夠可視化的網絡圖譜［6］，譜圖以節點形式聚集形成類似物簇［7］。在簇中，每個節點代表一種化合物，彼此之間通過直接或間接的方式進行節點連接，表示一些簡單的生化反應。相連化合物可能互為轉化產物，可通過將邊緣的質量差異轉換成結構差異，來推測識別新的化合物，進一步揭示藥物和轉化產物之間的作用關系［8］，輔助人們理解這些代謝物在生物過程中的生理和病理意義。目前分子網絡被廣泛應用于化合物的鑒定及發現、天然產物的代謝產物鑒定、天然產物化學成分的定性及定量等。該技術可與多種質譜數據處理工具連接，如代謝組學軟件Progenesis QI 等，作為代謝組學數據處理的補充。

氧氟沙星是一種人工合成的氟喹諾酮類抗生素，應用較為廣泛。研究表明氟喹諾酮類抗生素會導致嚴重或致殘的副作用，這些副作用可能是不可逆的［9］。目前關于氧氟沙星體外降解產物的研究較多［10-18］，體內代謝產物的研究尚未成熟。

本文以氧氟沙星為研究對象，利用超高效液相色譜-四極桿串聯飛行時間質譜（UHPLC-Q-TOF MS），建立特征分子網絡（FBMN），并結合Progenesis QI和分子網絡（GNPS）平臺提供的特征分子網絡快速分析氧氟沙星在小鼠肌肉、結腸、肝臟、腎臟、回腸和內容物中的代謝產物。

1 實驗部分

1.1 材 料

氧氟沙星標準品（純度99．3%，德國Dr．Ehrenstorfer公司）；二甲基亞砜、乙腈、甲醇、甲酸、甲酸銨（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 有限公司）；有機尼龍濾膜（0．22 μm，天津津騰公司）；FaVEx-NM50獸藥殘留凈化柱（巨研科技股份有限公司）。

1.2 儀器與軟件

1.2.1 儀 器ACQUITYTM超高效液相色譜儀、SYNAPT G2-Si 四極桿飛行時間質譜儀（美國Waters公司）［19-20］。GR22GⅢ高速冷凍離心機（日本Hitachi公司）；N-EVAPTM112氮吹儀配備OA-SYSTM 水浴加熱裝置（美國Organomation 公司）；MS200 多管渦旋混勻儀（杭州瑞誠儀器有限公司）；Vortex-genie 2渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；Milli-Q Integral 5超純水制備系統（法國默克公司）。

1.2.2 軟 件數據采集軟件MassLynx 4．1，數據處理軟件Progenesis QI 3．0（均為Waters公司提供）；GNPS（https：//gnps．ucsd．edu）；可視化軟件Cytoscape3．7．2。

1.3 實驗方法

1.3.1 給藥方法實驗選用6周齡C57小鼠10只，隨機分為兩組：對照組（10%二甲基亞砜）和氧氟沙星組（50 mg/mL，10%二甲基亞砜），每組5 只小鼠。于每日上午9：30 對小鼠進行灌胃，換算小鼠的每日灌胃劑量為200 μL，每天稱量小鼠體重。實驗期為14 d，實驗結束后取小鼠肌肉、結腸、回腸、肝臟、腎臟及內容物樣本。

1.3.2 樣品處理取均質后的樣品0．15 g（精確至0．01 g）于50 mL 聚丙烯離心管中，先加入10 mL 0．5%（體積分數）甲酸-乙腈溶液，2 500 r/min 振蕩提取30 min，10 000 r/min 離心10 min，轉移全部上清液；再加入10 mL 甲醇，2 500 r/min 振蕩提取30 min，10 000 r/min 離心10 min，轉移全部上清液。分別準確移取兩次上清液各5 mL于FaVEx-NM50快速柱，以每秒1滴流速加壓，收集濾液，于40 ℃氮吹至近干，用0．1%甲酸-乙腈∶0．1%甲酸-5 mmol/L 甲酸銨（13∶87，體積比）溶液定容至1 mL，渦旋復溶，經0．22 μm有機尼龍濾膜過濾，待上機［21］。

1.3.3 色譜與質譜條件色譜條件：色譜柱為Waters Acquity BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）；流動相A 為含0．1%甲酸的乙腈溶液，B 為pH 3．0 的5 mmol/L 甲酸銨溶液。梯度洗脫程序：0～0．50 min，87% B；0．50～10．00 min，87%～50% B；10．00～10．75 min，50%～5% B；10．75～12．25 min，5%B；12．25～12．50 min，5%～87% B；12．50～15．00 min，87% B。流速為0．4 mL/min；柱溫為40 ℃。

質譜條件：采用電噴霧（ESI）離子源正離子模式；質量數掃描范圍為m/z50～1 200；源溫為150 ℃，毛細管電壓為3．0 kV，錐孔電壓為40 V，脫溶劑氣為800 L/h，脫溶劑溫度為400 ℃，掃描時間：0～15 min；掃描間隔時間：0．1 s；全信息串聯質譜（MSE）模式檢測；分辨率模式，連續掃描數據采集，低碰撞能量為6 eV，高碰撞能量為25～45 eV。質量校正液為亮氨酸腦啡肽。

1.3.4 數據采集與處理方法采用MassLynx 進行數據采集，將采集的數據導入Progenesis QI 軟件中，進行峰識別、峰對齊、基線校正、去卷積和歸一化等預處理，依據人類代謝組數據庫（HMDB）對代謝物進行鑒定。鑒定結果以化合物ID（包括質量數、保留時間、碎片離子譜圖等信息）方式呈現。用Progenesis QI 處理數據篩選出豐度值大于3 000 的化合物，將csv 和MSP 文件登錄并上傳至GNPS 平臺，建立FBMN。在分析計算界面，基礎設置中將數據來源設置為Progenesis QI，母離子質量誤差和碎片離子質量誤差均設置為0．02 Da。高級分子網絡設置中，最小成對余弦分數設置為0．7，碎片離子最小匹配數設置為6，單節點最大連接節點數設置為10，單個網絡最大節點數設置為100。在高級譜庫搜索選項中，導入speclibs 文件，庫中搜索最小匹配峰數設置為6，得分閾值設置為0．7。多變量統計選項中，距離度量設置為cosine，在此基礎上進行分析，所得結果導入Cytoscape 軟件，將分析計算結果可視化為分子網絡圖。

2 結果與討論

2.1 Progenesis QI鑒定結果

樣品的總離子流色譜圖如圖1所示。利用Progenesis QI結合HMDB庫對所有小鼠組織樣本數據進行鑒定，共篩選出54 種小鼠體內可能的代謝物，信息包括代謝化合物的名稱、質荷比、保留時間、P值、偏差（ppm）。由顯著性檢驗得到P值，判斷化合物間的差異，結果均小于0．05，表示鑒定結果為碰巧出現的可能性小于5%，具有顯著意義。在鑒定的54種化合物中，大部分為內源性代謝物，共有2個與氧氟沙星代謝直接相關的化合物，即培氟沙星、N-氧化產物。其保留時間、加合離子以及母離子、子離子質量數的理論值和實際值偏差如表1所示，偏差均小于5 ppm。

表1 基于Progenesis QI軟件的氧氟沙星及代謝產物鑒定結果Table 1 The identified results of ofloxacin and its metabolites based on Progenesis QI software

圖1 代表性樣品的總離子流色譜圖Fig．1 Total ion chromatograms of representative samples

2.2 使用GNPS平臺繪制的特征分子網絡

在生成的FBMN 中，喹諾酮類成分可以被聚集，且質譜裂解存在一定的規律，所形成的特征分子網絡可視化圖如圖2所示。在GNPS庫中進行代謝物匹配，通過化合物二級質譜相似性原理，匹配到化合物氧氟沙星，分子式為C18H20FN3O4，加合離子為［M+H］+，中性離子質量為361．14 Da，質荷比為362．150 6，匹配度為0．941 496。

圖2 小鼠體內氧氟沙星及代謝產物的分子網絡圖Fig．2 Molecular network diagram of ofloxacin and its metabolites in mice

圖2 為氧氟沙星（m/z362．150 6［M+H］+，化學式C18H20FN3O4，保留時間2．48 min）分子集群，該集群包括16 個化合物節點，其中與氧氟沙星直接相連的有9個節點，經鑒定有5個化合物與氧氟沙星直接相關，推測的代謝化合物信息如表2所示。m/z334．156 2［M+H］+（保留時間為2．37 min）的節點，分子量與氧氟沙星相差CO 的精確質量數，是氧氟沙星開環氧化形成分子式為C17H20FN3O3的代謝產物；m/z378．145 5［M+H］+（保留時間為2．40 min）的節點，分子量與氧氟沙星相差1 個O 的精確質量數，是氧氟沙星的羥基化或某個N 上發生氧化，分子式為C18H20FN3O5的代謝產物，這兩個化合物與上述Progenesis QI 方法中鑒定出培氟沙星、N-氧化產物的結果一致。m/z318．160 9［M+H］+（保留時間為2．49 min）的節點，分子量與氧氟沙星相差CO2的精確質量數，是氧氟沙星發生了脫羧反應，形成分子式為C17H20FN3O2的代謝產物。m/z261．102 5［M+H］+（保留時間為2．50 min）的節點與m/z318．160 9［M+H］+的節點相差C3H7N 的精確質量數，是脫羧、N-脫烷基化后，分子式為C14H13FN2O2的代謝產物。m/z183．090 8［M+H］+（保留時間為2．71 min）的節點，推斷為脫氨基并開環脫羧后，分子式為C9H11FN2O 的代謝產物。根據小鼠體內代謝產物和分子網絡中的連接關系，推斷小鼠體內氧氟沙星可能的斷裂途徑如圖3所示。

表2 特征分子網絡推測氧氟沙星及代謝產物的結果Table 2 The results of ofloxacin and its metabolites speculated by FBMN

圖3 特征分子網絡分析推斷小鼠體內氧氟沙星可能的斷裂途徑Fig．3 Possible rupture pathways of ofloxacin in mice inferred by FBMN analysis

在代謝產物分析中，依據化合物的響應值，在各組織樣本中均檢出大量氧氟沙星原藥殘留，肝臟和回腸樣本中氧氟沙星原型累積最多，其次是腎臟、內容物和肌肉樣本，在結腸樣本中含量最少。如圖4 所示，代謝產物以脫羧產物為主，在各組織樣本中的響應值較高，在肝臟和回腸樣本中的含量最高，腎臟、肌肉和內容物樣本中較高，結腸樣本中的含量較少；脫羧后N-脫烷基化產物在肝臟和回腸樣本中的含量最高，在腎臟、肌肉和內容物樣本中較高，結腸樣本中的含量較少；N-氧化產物在肝臟樣本中的含量最高，在回腸、結腸和肌肉樣本中的含量較少；脫氨后開環脫羧產物在肝臟樣本中的含量最高，腎臟其次，在肌肉和內容物樣本中較少；培氟沙星在肝臟樣本中的含量最高，內容物樣本中其次，其他樣本中較少。綜上，肝臟是氧氟沙星的主要代謝場所，其代謝產物以脫羧產物為主。

圖4 氧氟沙星及代謝產物在不同樣本中的相對含量Fig．4 The relative contents of ofloxacin and its metabolites in different samples

3 結 論

本研究借助UHPLC-Q-TOF MS，使用Progenesis QI 進行數據預處理和鑒定，并首次使用GNPS 平臺的FBMN工具，建立特征分子網絡探究氧氟沙星在小鼠體內的代謝產物，得到小鼠體內氧氟沙星的5種代謝產物，分別為脫羧產物、培氟沙星、N-氧化產物、脫羧后N-脫烷基化產物、脫氨后開環脫羧產物，并得到小鼠體內氧氟沙星可能的斷裂途徑，發現肝臟為氧氟沙星主要的代謝場所。