應用宏基因組二代測序法評價支氣管鏡消毒滅菌效果的初步研究

金丁萍,胡燕燕,倪凱文,陳來娟,楊曉煊,陸 群

浙江大學醫學院附屬第二醫院,浙江杭州 310009

當前支氣管鏡的臨床應用越來越普及,其管腔狹小、結構復雜的特點使其護理清洗尤為困難,若基礎護理、消毒滅菌和儲存不規范,容易導致醫院感染發生。2019年美國公布的十大醫療危害技術中,明確指出了內鏡是增加醫院感染的風險因素[1]。在各種內鏡中支氣管鏡的細菌檢出率最高,達到40%,尤其是內腔細菌檢出率高達57.14%[2]。因此,保證支氣管鏡清洗、消毒、滅菌的效果非常重要,定期開展消毒效果的質量監測尤為重要。目前國內按照GB 15982-2012《醫院消毒衛生標準》,采用常規法進行病原微生物檢測,但檢測的敏感性較低,尤其對于少見、難培養的病原體檢出困難。宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)是近年來新發展起來的一種微生物檢測技術,具有靈敏度、準確性和檢測效率高的優勢[3],在臨床疑難復雜感染的診斷中發揮了巨大價值,但尚未應用于內鏡消毒效果監測中。本研究對經過規范消毒滅菌后的支氣管鏡進行mNGS檢測,并與常規培養法進行比較,初步評價mNGS對支氣管鏡消毒滅菌效果監測的價值。

1 材料與方法

1.1 研究材料

2022年6月,隨機抽取某三級甲等綜合性醫院內鏡室按規范流程清洗、過氧乙酸高水平消毒滅菌后的支氣管鏡8根(日本產),分別為型號BF-P260F(1根)、BF-260(1根)、BF-F260(1根)、BF-IT260(2根)、BF-UC260FW(1根)、BF-P60(2根)。嚴格遵循無菌操作原則,使用50 mL注射器抽取50 mL含相應中和劑的無菌液,從支氣管鏡的活檢口注入并全量收集至無菌瓶內,分別標記為樣本C1～C8待檢。準備8根新啟用并經過清洗和滅菌處理的清洗刷,從8根支氣管鏡活檢口插入,按10～15 cm的行進間距從上往下來回刷洗,直達出口處,約3 min后抽出清洗刷,同上采用50 mL無菌液從活檢口沖洗支氣管鏡,收集樣本標記為S1～S8待檢。

1.2 方法

1.2.1試劑與儀器

高通量測序相關試劑(武漢產)、營養瓊脂(英國產),MGISEQ-2000測序平臺(深圳產)、抽濾泵和0.45 μm一次性過濾杯(美國產)。

1.2.2檢測人員

所有樣本均由醫院感染管理科專職護士采集,送微生物實驗室進行檢測。檢測人員為檢驗科專職人員,具有相應檢測資質。

1.2.3操作方法

1.2.3.1 常規微生物培養方法

按照GB 15982-2012《醫院消毒衛生標準》消毒后內鏡的監測方法,將C1～C8、S1～S8共16份樣本分別取1 mL接種平皿,將預先冷卻至45℃的營養瓊脂每平皿傾注20 mL,經35℃培養2 d后記錄第一次菌落數,繼續培養至7 d后,記錄第二次菌落數。將剩余洗脫液的2/3量在無菌條件下采用0.45 μm濾膜過濾濃縮,分別將濾膜接種于已凝固的營養瓊脂平板上,經35℃培養2 d、7 d后分別記錄菌落數。

1.2.3.2 mNGS檢測方法

將經微生物常規培養后剩余的樣品(1/3的量)用0.45 μm濾膜過濾,按4份樣本過濾在同一張膜上;然后將濾膜放入50 mL無菌離心管內,用10 mL無菌等滲鹽水震蕩洗脫10 min,取出濾膜后將10 mL的液體以12 000 rpm離心5 min,棄上清,沉淀備用。獲取沖洗液和刷洗液各2管,分別標記為C1～C4、C5～C8、S1～S4、S5～S8,共4份樣本用于后續的mNGS方法檢測病原微生物。4份用于mNGS檢測的樣本采用柱提法提取核酸,并用限制性內切酶進行處理以打斷核酸。核酸片段主要通過末端修復、添加接頭、核酸磁珠純化進行文庫的構建;根據濃度混合核酸,環化擴增文庫得到DNB(DNA nanoball,DNA納米球);隨后通過儀器氣液系統將DNB泵入到芯片并加以固定,然后泵入測序試劑進行測序分析。每次檢測均設置陰性對照和陽性對照。

1.2.4評價方法

1.2.4.1 常規微生物培養結果評價方法

菌落總數(CFU/件)=兩平行平板的平均菌落數(CFU/平板)+濾膜上菌落數(CFU/濾膜)。

1.2.4.2 mNGS檢測結果評價方法

宏基因組測序數據下機數據經過服務器生物信息學分析得到初步報告,由實驗室具有生物信息學背景的臨床微生物專家解讀,主要依據同批次的陰陽性對照及以往對臨床樣本分析的經驗積累進行報告。主要評價指標包括嚴格比對序列數 (strict mapping reads number,SMRN)、深度(depth)、標準化為1M序列數(reads per million,RPM)。SMRN:指匹配到該病原體的序列數目,其多少與標本中病原體本身載量負荷、核酸提取量、人源序列比例等有關,序列數越高,表示標本中檢測到該病原體的可信度越高。深度:指該微生物基因組上某段序列被檢測到的次數,深度參數越大表示該微生物被檢測到的可靠性越高。RPM:指每百萬測得序列中比對到目標物種基因組的序列條數。

2 結果

2.1 常規微生物培養的結果

16份樣本經傾注法和濾膜法培養2 d和7 d后,均未檢出病原微生物。

2.2 mNGS檢測結果

混合后的4份樣本經初步生物信息學分析檢出不同序列數的抗輻射不動桿菌、銅綠假單胞菌、腐生葡萄球菌、豚鼠氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、遜德勒不動桿菌、卡他莫拉菌、巴斯德葡萄球菌等,其中每份標本均檢出銅綠假單胞菌。相同內鏡混合后的刷洗液與對應的沖洗液比較,檢出菌種數、序列數沒有明顯增加,未檢出特殊、難培養的病原微生物,見表1和表2。陰性對照中也包含不同序列的上述菌種,經微生物專家結合陰陽性對照及臨床經驗,進一步分析認為,4份樣本檢出菌均屬于背景菌。

表1 mNGS檢測8根支氣管鏡沖洗液的微生物結果

表2 mNGS檢測8根支氣管鏡刷洗液的微生物結果

3 討論

3.1 微生物培養法能滿足當前標準法處理支氣管鏡后滅菌效果評價的需求

近年來,隨著內鏡技術的發展及在臨床中的廣泛應用,軟式內鏡使用后的消毒效果評估越來越受到關注。本研究中的8根內鏡在高水平消毒及滅菌后分別采用沖洗和刷洗兩種方法采集樣本,并按GB 15982-2012《醫院消毒衛生標準》中的要求進行微生物培養,結果常規微生物培養2 d、7 d均為陰性,說明按照目前清洗、消毒、滅菌的標準處理支氣管鏡能夠達到要求。但通過常規培養法檢測病原微生物的種類有限,無法檢出特殊難培養的細菌、非典型病原體、病毒等;而且受限于細菌的生長特性,出報告時間2～15 d不等[4]。因此,采用該技術監測支氣管鏡的消毒效果存在假陰性的風險。

3.2 mNGS用于支氣管鏡滅菌效果的評價在性價比上并沒有優勢

mNGS可同時對數十萬到數百萬條DNA/RNA分子序列讀取,單次運行即可實現對細菌、真菌、病毒、寄生蟲以及非典型病原體的鑒定,尤其是能夠檢出未知及難培養病原體。且檢測速度快,在感染性疾病診斷中具有重要價值[5]。本研究對8根支氣管鏡的沖洗液和刷洗液進行mNGS檢測,結果檢出均為背景菌,未見難培養和特殊的病原體,這與王萍等[6]的研究結果一致。此外,支氣管鏡容易形成生物膜,是導致內鏡消毒、滅菌失敗的主要原因。即使嚴格按照規范對支氣管鏡進行清洗消毒,生物膜仍無法被徹底清除,存在交叉感染的風險[7]。對比本研究中刷洗液、沖洗液的mNGS檢測結果,發現刷洗后并未見微生物構成和序列數的明顯增加,可能與該批次支氣管鏡的日常清洗和維護較好、沒有明顯的生物膜形成有關。此外,mNGS檢測的成本明顯高,對于常規支氣管鏡滅菌效果的評價并不合適。

3.3 mNGS用于支氣管鏡滅菌效果的評價還需要更多研究

由于本研究是首次對支氣管鏡的沖洗液和刷洗液進行mNGS檢測,對標本質量控制、結果解讀還缺乏統一標準,且二代測序技術敏感度高、背景核酸干擾、外源性核酸污染、定植菌的混雜等容易導致假陽性結果,檢測出的病原微生物基因片段也可能是經過高水平消毒滅菌后死亡病原體的殘骸。因此,本研究認為研究中mNGS未檢出特殊、難培養的病原體才具有重要的臨床價值,而對檢出常見病原微生物及其序列數高低的臨床意義還有待明確,需要排除檢測過程中的污染,并結合培養法的結果做出綜合判斷。

3.4 本研究的局限性

首先是選取的支氣管鏡數量有限,沒有對支氣管鏡使用的年限進行分層。第二,因為考慮研究成本,沒有對每根支氣管鏡的樣本逐個進行mNGS檢測,而是將8根支氣管鏡的沖洗、刷洗的16個樣本合并成4份,不能區分單根支氣管鏡的情況。第三,由于缺乏內鏡采樣標本質量控制和結果解讀的標準,對mNGS檢測結果的精準判斷還有待更多的研究。

(致謝:感謝護理部封秀琴主任、醫院感染管理科董麗老師對本研究的悉心指導!)