黃精配方顆粒質量標準研究?

魯文潔,萬曉瑩,宋志前,彭詩濤,劉振麗,寧張弛△,王 淳△

(1.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所,北京 100700; 2.上海林清軒生物科技有限公司,上海 201600)

黃精為百合科黃精屬植物滇黃精(PolygonatumkingianumColl.et He msl.)、黃精(PolygonatumsibiricumDelar.ex Redoute)或多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)的干燥根莖,具有補氣養陰、益腎、健脾潤肺等功效,常用于滋補強身和治療食欲不振、腎精不足及脾胃氣虛等病證,是中醫常用補益藥物之一[1-3]。酒黃精是黃精的炮制品。酒制后黃精的刺激性降低,益腎健脾潤肺之功效增強[2,4]。隨著生產技術的不斷進步,中藥配方顆粒取得了較好的發展,相較于傳統湯劑,中藥配方顆粒具有免煎易服、便于攜帶和調劑等優點[5],但其成分復雜,仍存在標準不明確、劑量不統一、臨床合理性需要進一步驗證等問題[6]。因此,亟須建立切實可行的配方顆粒質量標準,用于標化不同的飲片用藥形式及不同廠家的產品,從而提高臨床用藥的準確性與療效的一致性。

目前,配方顆粒一般選用與原料飲片相同的有效成分或指標成分作為質量控制指標,如秦皮及其配方顆粒均選擇秦皮甲素和秦皮乙素[7],側柏葉及其配方顆粒均選取槲皮苷[8]。黃精主要含有多糖、黃酮、皂苷等成分,其中多糖是其主要活性成分之一[9-10]。2020版《中華人民共和國藥典》中以多糖為主要有效成分的中藥飲片,常采用紫外分光光度法測定多糖含量,而且多糖分子量(molecular weight,MW)及其分布、單糖組成分析也已成為多糖質量控制的重要方法[11]。在配方顆粒制備工藝中,為了便于成型和制粒,一般需要加入輔料。常用的輔料主要有糊精、可溶性淀粉和乳糖等[12]。糊精、可溶性淀粉和乳糖均為糖類輔料。然而,藥典中采用的黃精多糖的定性和定量方法會使這些輔料在酸的作用下水解成糖類而被檢測出來,進而影響多糖測定結果的準確性。有研究表明黃精酒制前后多糖的MW及其分布發生改變,且免疫調節作用與多糖的MW及其分布密切相關[13]。綜上,若能排除輔料對多糖含量測定的干擾,再以多糖的MW及其分布為質量控制指標建立黃精和酒黃精配方顆粒質量標準,可為完善黃精配方顆粒的評價方法提供參考。

因此,本研究以目前市場上廣泛使用的多花黃精為研究對象,通過酶解法探索去除配方顆粒輔料干擾的辦法,選取合適的輔料制備黃精和酒黃精配方顆粒,然后以多糖MW及其分布為指標建立高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)特征圖譜,從而為以多糖為指標的中藥配方顆粒質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀(含G-1322A在線真空脫氣機、G-1311A高壓四元泵、G-1313A標準自動進樣器、G-1316A恒溫箱、G-1362A示差折光檢測器、Agilent HP化學工作站),美國Agilent公司;PL403型 1/1 000電子天平,梅勒-卡利多(上海)有限公司;YP1002N型1/100電子天平,上海精密化學儀器有限公司;KQ-600VDV雙頻數控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;RE-52A型旋轉蒸發器,上海振捷實驗設備有限公司。

1.2 試藥

高溫α-淀粉酶(批號9001-19-8,酶活力40 000 U/g)、糖化酶(批號8109021,酶活力 100 000 U/g),索萊寶科技有限公司;3批黃精藥材(編號PC-1、PC-2、PC-3)分別購自廣東省清遠市連州市、湖南省湘西州龍山縣、安徽省六安市霍山縣,經北京中醫藥大學中藥學院劉春生教授鑒定,均為百合科植物多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua;蒽酮,批號20110112,天津市福晨化學試劑廠;葡聚糖標準品,MW分別為 1 000、5 000、12 000、50 000、80 000、150 000、270 000、410 000、670 000、800 000,批號分別為BCBC9153V、BCBF6367V、BCBD7990V、BCBD4968V、BCBD9858V、BCBF0969V、MSDS31423、MSDS31424、MSDS31425、BCCC6696,美國 Sigma公司;石油醚,60～90 ℃,批號20170522,北京化工廠;可溶性淀粉,批號20191011,國藥集團化學試劑有限公司;糊精,批號20200826,曲阜天利藥用輔料有限公司;其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃精和酒黃精飲片干浸膏的制備

依據2020版《中華人民共和國藥典》[3]和課題組前期確定的工藝條件[13],取3批黃精藥材(編號為PC-1、PC-2、PC-3)分別制備得到黃精和酒黃精飲片。

黃精飲片:取黃精藥材5 kg,洗凈,切厚片(2～4 mm),置于鼓風干燥箱,45 ℃干燥至含水量15%以下,即得。

酒黃精飲片:取黃精飲片5 kg,加黃酒1 kg,拌勻,悶潤過夜至酒吸盡;置蒸鍋內隔水加熱,燉至16 h,取出,同上干燥處理,即得。

分別取上述黃精和酒黃精飲片各約100 g,加入10倍量水,100 ℃回流提取2次,每次1 h,濾過,合并濾液,減壓干燥,即得黃精和酒黃精干浸膏,稱重,計算出膏率。結果顯示3批黃精飲片出膏率分別為63.89%、66.79%、64.92%,酒黃精飲片出膏率分別為54.97%、51.09%、53.93%。

2.2 酶解條件的考察

2.2.1 適宜酶的篩選 選取高溫α-淀粉酶、糖化酶、高溫α-淀粉酶和糖化酶兩種酶協同處理以考察單一酶和兩種酶對輔料可溶性淀粉和糊精的酶解效果。

2.2.1.1 酶溶液的配制 取高溫α-淀粉酶(40 000 U/g)50 mg,精密稱定,加水溶解并定容至50 mL容量瓶中,得到酶活力為40 U/mL的高溫α-淀粉酶溶液。

取糖化酶(100 000 U/g)50 mg,精密稱定,加水溶解并定容至100 mL容量瓶中,得到酶活力為50 U/mL的糖化酶溶液。

2.2.1.2 酶解反應 高溫α-淀粉酶的酶解:分別取糊精和可溶性淀粉各0.25 g,精密稱定,分別置于錐形瓶中,加熱水20 mL使溶解,放冷,按輔料:酶為1:1.5(g/mL)的比例加入高溫α-淀粉酶溶液,混勻,置于90 ℃恒溫干燥箱中保溫0.5 h,即得高溫α-淀粉酶的酶解溶液。

糖化酶的酶解:分別取糊精和可溶性淀粉各0.25 g,精密稱定,按輔料:酶為1:2(g/mL)的比例加入糖化酶溶液,混勻,置于58 ℃恒溫干燥箱中保溫2 h,升溫至120 ℃,酶失活10 min,濾過,放冷至室溫,定容至25 mL容量瓶中,即得糖化酶處理的酶解溶液。

兩種酶協同反應:分別取糊精和可溶性淀粉各0.25 g,精密稱定,先按輔料:酶為1:1.5(g/mL)的比例加入高溫α-淀粉酶溶液,置于恒溫干燥箱中90 ℃保溫0.5 h,取出,放冷至室溫,再以糊精:酶為1:2(g/mL)的比例加入糖化酶溶液,置于恒溫干燥箱中58 ℃保溫2 h,再同上法滅酶和定容,即得兩種酶協同處理后的酶解溶液。

2.2.1.3 色譜條件 色譜柱:Waters Ultrahydrogel 250柱(7.8 mm×300 mm)與Waters Ultrahydrogel 1 000柱(7.8 mm×300 mm)串聯。柱溫:40 ℃;示差折光檢測器(refractive index detector,RID)溫度:40 ℃;流動相:水;流速:0.6 mL/min。

2.2.1.4 單一酶與兩種酶對可溶性淀粉和糊精酶解效果考察 精密吸取各供試品溶液20 μL,按2.2.1.3項色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。由圖1可見,高溫α-淀粉酶處理的可溶性淀粉和糊精在tR=30 min處存在未被完全水解的低分子量多糖峰;糖化酶處理的可溶性淀粉和糊精在tR=10～15 min和tR=30 min部分均有多聚糖鏈殘留。糖化酶和高溫α-淀粉酶協同處理的可溶性淀粉和糊精僅在tR=34 min部分檢測到一個寡糖峰。兩種酶處理可溶性淀粉和糊精比單一酶處理效果更好。因此,本研究選用兩種酶協同處理的方法去除輔料。由于可溶性淀粉聚合度比糊精高,且和糊精酶解的結果相似,后續酶解工藝的考察均以可溶性淀粉作為研究對象。

注:a.糖化酶;b.高溫α-淀粉酶;c.糖化酶+高溫α-淀粉酶;A.可溶性淀粉;B.糊精

2.2.2 高溫α-淀粉酶加酶量的考察 取可溶性淀粉約0.25 g,4份,精密稱定,分別置于錐形瓶中,精密加入熱水25 mL使溶解,按可溶性淀粉:酶用量為1:1(g/mL)、1:1.5(g/mL)、1:2(g/mL)、1:3(g/mL)的比例加入高溫α-淀粉酶溶液,混勻,置于恒溫干燥箱中90 ℃保溫反應。待反應時間達到0.5 h時,分別取出1 mL反應液,加入1滴碘液,觀察顏色反應,以橙紅色為反應終點[14]。結果顯示,隨著酶用量的增加,反應液顏色逐漸變淺,當可溶性淀粉:酶用量為1:1(g/mL)時,反應液呈棕褐色,1:1.5(g/mL)時呈橙紅色;1:2(g/mL)及以上時呈淺黃色且不再變化。但高溫α-淀粉酶水解的程度過高會抑制糖化酶的作用,常選擇水解液與碘液反應為橙紅色或橙色作為反應終點[15]。因此,以1:1.5(g/mL)的比例作為高溫α-淀粉酶的加酶量。

2.2.3 糖化酶加酶量的考察 取可溶性淀粉約0.25 g,4份,精密稱定,分別置于錐形瓶中,精密加入熱水20 mL使溶解,以可溶性淀粉:酶用量1:1.5(g/mL)的比例先加入高溫α-淀粉酶溶液,混勻,置于恒溫干燥箱中90 ℃保溫反應0.5 h,取出,放冷,再分別按可溶性淀粉:酶用量為1:0.1(g/mL)、1:0.2(g/mL)、1:1(g/mL)、1:2(g/mL)加入糖化酶溶液,混勻,置于58 ℃恒溫干燥箱中保溫2 h,升溫至120 ℃,酶失活10 min,濾過,放冷至室溫,定容至25 mL容量瓶中,即得。

精密吸取上述供試品溶液20 μL,按2.2.1.3項色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。如圖2所示,隨著糖化酶加酶量的增大,可溶性淀粉MW>5.6×103部分的色譜峰面積逐漸減小,當可溶性淀粉:糖化酶用量為1:2(g/mL)時,未檢測到色譜峰。因此,以1:2(g/mL)的比例作為糖化酶的最佳加酶量。

注:a.1:0.1(g/mL);b.1:0.2(g/mL);c.1:1(g/mL);d.1:2(g/mL)

2.3 高溫α-淀粉酶和糖化酶對黃精和酒黃精多糖的影響

2.3.1 黃精和酒黃精多糖的提取方法 按照課題組前期確定的方法,分別取黃精和酒黃精飲片約10 g,加入10倍量水,100 ℃提取1 h,濾過,60 ℃減壓濃縮至100 mL。待冷卻到室溫后,緩慢加入乙醇,不斷攪拌至乙醇濃度為90%,4 ℃冷藏過夜,離心,棄去上清液,沉淀用90%乙醇洗滌3次,每次5 mL,冷凍干燥,即得[13]。

2.3.2 供試品溶液的配制 根據最佳酶解條件對黃精和酒黃精多糖進行酶解反應。取黃精和酒黃精多糖各0.1 g,精密稱定,分別置于錐形瓶中,加熱水20 mL使溶解,放冷,按多糖:酶用量為1:1.5(g/mL)的比例加入高溫α-淀粉酶溶液,置于90 ℃恒溫干燥箱中保溫0.5 h,取出,放冷,按輔料:酶用量為1:2(g/mL)的比例加入糖化酶溶液,58 ℃保溫2 h,升高溫度至120 ℃,保溫10 min使酶滅活,放冷,轉移至25 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,濾過,即得。

2.3.3 陰性對照溶液的配制 稱取黃精和酒黃精多糖各0.1 g,精密稱定,加熱水20 mL使溶解,同法制備陰性對照溶液。

2.3.4 樣品的測定 精密吸取上述樣品溶液和陰性對照溶液各20 μL,在2.2.1.3色譜條件下進樣測定。結果如圖3所示,經酶處理后的黃精和酒黃精多糖的MW及其分布與陰性對照溶液基本一致,表明這兩種酶對黃精和酒黃精多糖的MW及其分布均沒有影響。

注:a.陰性對照溶液;b.酶處理樣品; A.黃精多糖;B.酒黃精多糖

2.4 黃精和酒黃精配方顆粒特征圖譜的建立

2.4.1 黃精和酒黃精配方顆粒的制備 按照《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》[16]的制備工藝,取各批次黃精和酒黃精干浸膏粉50 g,按浸膏粉:輔料為1:1的比例進行混勻,以75%乙醇為潤濕劑制作軟材,24目篩制粒,60 ℃下常壓干燥,即得。

2.4.2 標準品溶液的制備 分別取MW為800 000、670 000、410 000、270 000、150 000、80 000、50 000、12 000、5 000和1 000的葡聚糖標準品適量,精密稱定,加水分別制成每1 mL含2.58 mg、1.86 mg、1.94 mg、2.18 mg、2.4 mg、2.32 mg、2.06 mg、2.16 mg、1.94 mg和2.01 mg的溶液,即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取各批次配方顆粒0.5 g,精密稱定,加80%乙醇150 mL,加熱回流1 h,趁熱濾過,殘渣用80% 熱乙醇洗滌3 次,每次10 mL,加水20 mL使溶解。按輔料:酶用量為1:1.5(g/mL)的比例加入高溫α-淀粉酶溶液,置于90 ℃恒溫干燥箱中保溫0.5 h,取出,放冷,再以輔料:酶用量為1:2(g/mL)的比例加入糖化酶溶液,58 ℃保溫2 h,升高溫度至120 ℃,保溫10 min使酶滅活,放冷,轉移至25 mL容量瓶中,加水定容,搖勻,濾過,即得。

2.4.4 陰性對照溶液的制備 稱取可溶性淀粉0.25 g,精密稱定,按2.4.3項供試品溶液制備方法處理,作為陰性對照溶液。

2.4.5 方法學考察

2.4.5.1 標準曲線的繪制 分別精密吸取上述10種葡聚糖標準品溶液各20 μL,注入液相色譜儀,測定。以保留時間tR(min)為橫坐標,葡聚糖標準品的l gMW為縱坐標進行回歸處理,得線性回歸方程為:lgMW=-0.227 9tR+10.335,r=0.995 3。結果表明,葡聚糖標準溶液在MW為1 000～800 000 Da范圍內lgMW與tR線性關系良好。結果見圖4。

圖4 葡聚糖標準品的lg MW與tR線性關系考察結果

2.4.5.2 精密度試驗 精密吸取編號為PC-1的黃精配方顆粒供試品溶液20 μL,連續進樣6次,按2.2.1.3項下色譜條件進行測定,采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》對精密度樣品的圖譜進行自動匹配,不經多點校正。結果顯示連續進樣6次所得色譜圖相似度均大于0.95,且RSD值小于1%,說明該方法的精密度符合要求。

2.4.5.3 穩定性實驗 精密吸取藥材編號為PC-1的黃精飲片制備的配方顆粒供試品溶液20 μL,分別于0、2、4、6、8、24 h進樣,同上進行自動匹配,不經多點校正。結果顯示6次所得色譜圖相似度均大于0.95,且RSD值小于1%,表明該方法的穩定性符合要求且該溶液在24 h內是穩定的。

2.4.5.4 重復性試驗 取藥材編號為PC-1的黃精飲片制備的配方顆粒0.5 g,6份,按2.4.3項下的供試品溶液的制備方法處理,精密吸取各重復性樣品溶液20 μL進樣,同上進行自動匹配,不經多點校正。結果顯示6次所得色譜圖相似度均大于0.95,且RSD值小于1%。說明該方法的重復性符合要求。

2.4.6 特征圖譜的建立

精密吸取供試品溶液和陰性對照溶液20 μL,按2.2.1.3項下色譜條件測定,結果見圖5。經高溫α-淀粉酶和糖化酶協同處理后,可溶性淀粉陰性對照溶液在MW>10 kDa部分的糖鏈已完全水解,僅在MW為407 Da(tR=34 min)處檢測到1個寡糖峰,對黃精配方顆粒多糖的測定沒有影響。黃精和酒黃精配方顆粒多糖均檢測到5個色譜峰,Mw分別為2.4×103,4.8×102,300,100,2.5 kDa,但酒黃精配方顆粒多糖Mw>100 kDa部分的峰面積均大于黃精配方顆粒。相似度評價結果(表1)顯示,黃精配方顆粒之間的相似度范圍是0.909～0.985,均大于0.9;酒黃精配方顆粒之間的相似度范圍是0.927～0.990,均大于0.9;黃精與酒黃精配方顆粒之間的相似度范圍是0.396～0.496,均小于0.5;表明該方法能很好地區分黃精和酒黃精配方顆粒,可用于黃精和酒黃精配方顆粒的質量控制。

表1 黃精和酒黃精配方顆粒多糖的HPGPC圖相似度結果

圖5 黃精和酒黃精配方顆粒多糖的HPGPC圖

3 討論

目前,以多糖為質量控制指標的中藥配方顆粒質量標準研究已見報道,且多采用紫外分光光度法測定多糖含量[17-19]。相關文獻可以分為2類,一類是測定配方顆粒中間體浸膏粉中的多糖含量,并以此作為配方顆粒的質量標準[20],另一類是先使用工具酶去除配方顆粒輔料,再通過多次醇沉除去輔料水解產生的單糖并獲得相應多糖,然后再測定[21]。現代研究表明,多糖的生物活性與其初級結構密切相關,而紫外分光光度法不能反映多糖的真實狀態[22-23],因此,本研究以多糖的MW及其分布為指標,對配方顆粒進行質量控制。

課題組前期結果顯示,黃精多糖的免疫活性與其MW及分布情況密切相關,同時炮制后黃精多糖MW及其分布情況也發生了改變[13]。因此,依據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求(征求意見稿)》中輔料與浸膏粉混合比不得超過1:1的規定,分別以可溶性淀粉按1:1制備黃精和酒黃精配方顆粒,通過酶法去除輔料,采用HPGPC法建立配方顆粒質量標準。結果顯示,可溶性淀粉經酶法處理后,MW>10 kDa的部分已全部轉變成寡糖,說明輔料不會干擾配方顆粒這部分多糖的測定。酒黃精配方顆粒多糖在MW>3 kDa部分色譜峰的峰面積均大于黃精配方顆粒多糖,且MW也均存在差異,說明該方法可以用來區分黃精和酒黃精配方顆粒,但是對于市售輔料種類和用量均未知的樣品還需進一步考察。