芪藶強心膠囊對慢性心衰大鼠認知功能障礙的影響及機制研究?

竇晉芳,趙 躍,常佩芬,高瑜倩,彭嘉冉,黑穆榮,王志淼,張洪嘉,朱海燕,2,3△

(1.北京中醫藥大學東直門醫院,北京 100700;2.北京中醫藥大學中醫內科學教育部重點實驗室,北京 100700;3.北京中醫藥大學心血管病研究所,北京 100700)

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)簡稱慢性心衰,是一種由不同致病因素損傷心臟功能及結構,導致心功能逐漸減退或喪失,供血難以滿足機體代謝需要及心臟內分泌功能失調的疾病[1]。研究發現CHF住院患者中約有50%會逐漸出現程度不同的認知功能障礙,嚴重影響其生存質量、護理難度和預后,但具體機制尚不明確[2]。CHF的發生往往會激活體內的腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system,RAS),研究表明,血管緊張素Ⅱ轉化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)不但能夠改善CHF患者的心功能,還能改善其認知功能障礙[3]。益氣溫陽、活血利水中藥芪藶強心膠囊在臨床治療CHF療效顯著,研究證實其還可抑制體內血管緊張素(angiotensin,Ang)Ⅱ的過度產生及激活[4-5],在此基礎上推測芪藶強心膠囊有改善CHF后認知障礙的作用,機制可能與AngⅡ有關。本課題采用心梗后心衰大鼠模型,觀察中藥芪藶強心膠囊對CHF后認知功能障礙的干預作用。本研究經北京中醫藥大學東直門醫院動物倫理委員會審批,編號21-36。

1 材料

1.1 動物

12周齡雄性SPF級SD大鼠,體質量(210±10)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號SCXK(京)2016-0006,于東直門醫院屏障環境動物室飼養。飼養環境溫度20～24 ℃,相對濕度40%～45%,每日光照10～12 h。所有動物食水自由并保持墊料清潔。

1.2 藥物及主要試劑

芪藶強心膠囊,國藥準字Z20040141,石家莊以嶺藥業有限公司;纈沙坦片,國藥準字H20051350,魯南貝特制藥有限公司;大鼠AngⅡ、β淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)42 ELISA試劑盒,貨號CSB-E04494r、CSB-E10786r,武漢華美生物工程有限公司;注射用青霉素鈉,貨號140051248,江西科達動物藥業有限公司;4%組織細胞固定液,貨號P1110,北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器

MD-021型Morris水迷宮系統,上海移數信息科技有限公司;FX-7202型心電圖機,日本CardiMax公司;ALC-V8S型小動物呼吸機,上海奧爾科特生物技術有限公司;Ve-vo2100型超高分辨率小動物超聲影像系統,探頭型號MS-201,加拿大Visual Sonics公司;BX60型光學顯微鏡,日本Olympus公司。

2 方法

2.1 心梗后心衰大鼠造模

適應喂養1周后,大鼠按0.5 g/100 g 體質量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后連接呼吸機,參照文獻中的方法造模[6],順肋間隙于大鼠胸骨旁第3、4肋間作1.5 cm切口,逐層分離皮下組織、肌肉,打開胸腔和心包膜,在動脈圓錐與左心耳之間下約2 mm處結扎左冠狀動脈前降支。假手術組大鼠只在同樣位置穿線而不結扎。大鼠以術后24 h心電圖出現明顯ST段抬高和病理性Q波,至少分布于 I、aVL、V3～V6導聯,可兼有V1、V2導聯,且病理性Q波大于7個為心梗造模成功標準。

2.2 分組及給藥

將造模成功的大鼠隨機分為模型組、芪藶組和纈沙坦組,每組18只。假手術組大鼠18只。藥物采用去離子水充分溶解形成均勻的混懸液。按60 kg成人臨床用量的10倍進行換算,芪藶組給予芪藶強心膠囊0.6 g/kg/d,纈沙坦組給予纈沙坦片13.3 mg/kg/d。每日給予假手術組和模型組大鼠等體積去離子水。術后第2天開始灌胃給藥,持續2個月后進行后續檢測。

2.3 Morris水迷宮實驗

藥物干預結束后進行Morris水迷宮實驗。定位航行實驗:歷時3 d,每日固定時間段,從除平臺所在象限外的3個象限中分別任選一點將大鼠放入水池,大鼠找到平臺后結束,記錄大鼠找到平臺的時間。空間探索試驗:歷時1 d,撤除平臺后將大鼠從除原平臺所在象限外的3個象限中分別任選一點放入水池,120 s后實驗結束,記錄大鼠在120 s內跨越平臺區的次數。

2.4 超聲心動圖檢測心功能

水迷宮實驗后進行超聲心動圖檢測。大鼠麻醉后,取左室乳頭肌短軸切面,測量心室射血分數(ejection fraction,EF)和心室縮短分數(fractional shortening,FS),每次取3～5個心動周期,重復3次取平均值。

2.5 血流動力學檢測心功能

大鼠麻醉后頸部備皮,沿正中線剪開4 cm的切口,將頸前肌群鈍性分離以暴露右頸總動脈并于遠心端處結扎,于近心端夾閉動脈夾,于右頸總動脈上作1.5 mm切口,將灌洗過肝素鈉溶液的導管插入動脈,推向心臟直至進入左心室,待信號穩定后測定左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)、左心室內壓最大上升速率(the maximal rate of increase of left ventricular pressure,+dp/dt max)和左心室內壓最大下降速率(the maximal rate of decrease of left ventricular pressure,-dp/dt max)。

2.6 處死與取材

記錄大鼠體質量(body mass,BM)。大鼠麻醉后從腹主動脈處采血,開胸后摘下心臟,于4 ℃預冷的0.9%氯化鈉溶液中涮洗后擦干,電子天平稱取心臟質量(heart mass,HM)。心臟質量指數(heart mass index,HMI)=HM(mg)/BM(g)。同時,用照相機拍攝各組大鼠心臟大體結構照片。于大鼠心臟的最大橫截面處切取組織塊,立即浸泡于4%組織細胞固定液中固定。用鍘刀切掉動物頭部,剝離皮毛及顱骨,暴露右側枕葉皮質下海馬區,鑷子夾取海馬放入凍存管,迅速投入液氮。

2.7 心肌HE染色和海馬尼氏染色

心肌組織經石蠟包埋后切片,于二甲苯中充分脫蠟,梯度乙醇下行各2 min,蘇木素染色8 min,1%鹽酸酒精分化30 s,伊紅染色2 min,梯度乙醇上行各2 min,二甲苯透明后封片,光學顯微鏡下觀察大鼠心肌組織;大鼠腦組織制成冰凍切片,去離子水中洗3 min,避光加入尼氏染色試劑盒A液,37 ℃溫育15 min,梯度乙醇下行各5 s,B液中分化,梯度乙醇上行各1 min,二甲苯透明后封片,光學顯微鏡下觀察大鼠海馬神經元。

2.8 ELISA檢測血漿和海馬AngⅡ、海馬Aβ42濃度

按試劑盒說明書進行操作,向96孔板中依次加入標準品和待測樣本、抗體工作液、辣根過氧化物酶、底物混合液和終止液,于450 nm波長下讀取光密度(optical density,OD)值,檢測血漿和海馬中AngⅡ、海馬Aβ42濃度。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠術后24 h心電圖比較

術后24 h,假手術組大鼠心電圖未見明顯異常,但模型組、芪藶組和纈沙坦組大鼠心電圖可見明顯的ST段抬高和病理性Q波,至少分布于 I、aVL、V3～V6導聯,可兼有V1、V2導聯,且病理性Q波大于7個,符合心梗造模成功標準,見圖1。

A.假手術組;B.模型組;C.芪藶組;D.纈沙坦組

3.2 各組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數比較

在定向航行實驗中,從第1天到第3天,各組大鼠逃避潛伏期時間均呈現遞減的趨勢。在空間探索實驗中,與假手術組大鼠比較,模型組大鼠穿越平臺次數明顯減少(P<0.01);與模型組大鼠比較,芪藶組和纈沙坦組大鼠穿越平臺次數明顯增多(P<0.05),見圖2。

注:與假手術組比較**P<0.01;與模型組比較# P<0.05

3.3 各組大鼠EF值、FS值比較

與假手術組比較,模型組大鼠EF值和FS值明顯降低(P<0.01);與模型組比較,芪藶組大鼠EF值和FS值顯著升高(P<0.05),纈沙坦組大鼠EF值和FS值較模型組有升高趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05),見圖3。

注:與假手術組比較**P<0.01;與模型組比較# P<0.05,##P<0.01;心室射血分數(EF);心室縮短分數(FS)

3.4 各組大鼠血流動力學指標比較

與假手術組比較,模型組大鼠+dp/dt max、-dp/dt max和LVSP顯著降低(P<0.05),LVEDP顯著升高(P<0.05);與模型組比較,芪藶組大鼠LVSP顯著升高(P<0.05),纈沙坦組大鼠LVSP顯著升高(P<0.05)、LVEDP顯著降低(P<0.05),見圖4。

注:與假手術組比較*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較# P<0.05;左心室收縮壓(LVSP);左心室舒張末壓(LVEDP);左心室內壓最大上升速率(+dp/dt max);左心室內壓最大下降速率(-dp/dt max)

3.5 各組大鼠HMI比較

各組大鼠HMI比較差異均無統計學意義(P>0.05),見圖5。

圖5 各組大鼠心臟質量指數(HMI)比較(n=6)

3.6 各組大鼠心臟大體結構比較

通過觀察大鼠心臟大體照片,與假手術組比較,術后第60天模型組大鼠心臟體積變大,心室壁尤其左室前壁結構發生明顯變化,室壁變薄,心尖塌陷范圍較大,表現為廣泛的蒼白色纖維化;與模型組比較,芪藶組和纈沙坦組大鼠心臟大體結構略有改善,但差異不明顯,見圖6。

A.假手術組;B.模型組;C.芪藶組;D.纈沙坦組

3.7 各組大鼠心肌組織HE染色及海馬尼氏染色結果比較

假手術組大鼠心肌細胞形態正常,結構完整,排列整齊致密,胞核居中,染色均勻;模型組大鼠心肌細胞結構模糊,出現水腫,細胞間隙增大,細胞排列紊亂,有明顯的炎性細胞浸潤;芪藶組及纈沙坦組大鼠的心肌結構較模型組有不同程度改善,心肌纖維更完整,有少量炎性細胞浸潤,細胞染色相對較均勻。假手術組大鼠海馬神經元多且染色深,模型組大鼠海馬神經元數目減少且染色較淺,芪藶組和纈沙坦組大鼠較模型組有不同程度改善,神經元數目增加,染色加深,見圖7。

A.假手術組;B.模型組;C.芪藶組;D.纈沙坦組

3.8 各組大鼠血漿和海馬AngⅡ、海馬Aβ42濃度比較

與假手術組比較,模型組大鼠的血漿AngⅡ、海馬AngⅡ和海馬Aβ42濃度顯著升高(P<0.01);與模型組比較,芪藶組和纈沙坦組大鼠的血漿AngⅡ和海馬Aβ42濃度顯著降低(P<0.05),芪藶組大鼠的海馬AngⅡ濃度明顯降低(P<0.05),纈沙坦組大鼠的海馬AngⅡ濃度較模型組有降低趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05),見圖8。

注:與假手術組比較**P<0.01;與模型組比較# P<0.05,##P<0.01;血管緊張素Ⅱ(AngⅡ);β淀粉樣蛋白42(Aβ42)

4 討論

心腦之間的關系自古以來密不可分,心主神明,腦為髓海[7]。CHF的主要病機是心氣虛造成脈絡瘀阻,進而形成痰濕水停。如心氣不足影響氣機的運行和血液的灌注,就會影響氣血流通和神機運轉,神機失用從而發生認知障礙。芪藶強心膠囊是當前臨床治療CHF的有效中藥組方[8-9],由黃芪、附子、人參、丹參、紅花、葶藶子等組成,具有益氣溫陽、活血通絡、利水消腫的作用。已有研究表明,芪藶強心膠囊既能增強心肌收縮力,增加心排血量[10],又可以抑制RAS過度激活,從而減緩CHF的進展[4-5]。

本研究采用心梗后心衰大鼠模型,模型組大鼠的心功能較對照組明顯下降,EF值約34.39%,符合EF≤45%的心衰標準[11-12]。超聲心動圖、血流動力學、心臟大體結構和組織病理結果表明,芪藶強心膠囊確實能夠改善心梗后心衰大鼠的心功能,減輕心肌組織的損傷。ELISA結果顯示,芪藶強心膠囊和陽性對照藥纈沙坦均能抑制血液中AngⅡ的濃度。CHF發生時,RAS的激活十分關鍵,而AngⅡ是RAS中最重要的活性因子,它與血管緊張素1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R)結合后能夠導致心肌肥厚,心臟負荷增加,從而加速心臟纖維化和心衰的進程[13]。降低AngⅡ濃度或抑制其與AT1R結合,能夠顯著提高心衰患者的心功能,減慢心衰的進展[14-15]。

除了循環系統外,腦部也有自己的RAS系統[16],參與學習、記憶、壓力和性行為等調節[17]。AngⅡ與AT1R結合可導致炎癥、氧化應激增加,血腦屏障破壞,減少腦血流并增加Aβ的沉積,產生神經毒性或損傷神經元,從而對認知功能產生影響[18-19]。ELISA結果發現,模型組大鼠腦內AngⅡ濃度較假手術組顯著增加,芪藶強心膠囊能夠降低腦內AngⅡ濃度,但纈沙坦組與模型組比較僅有下降趨勢,這可能與芪藶強心膠囊能夠透過血腦屏障有關,而目前關于纈沙坦能否通過血腦屏障的研究結果尚不一致[20]。

Morris水迷宮實驗表明,心衰模型大鼠的認知能力受損主要表現在空間學習記憶能力上,而芪藶強心膠囊和纈沙坦能有效改善心衰大鼠的空間學習記憶能力。海馬作為學習、記憶的神經中樞和解剖基礎,與認知功能密切相關。尼氏染色發現,模型組大鼠海馬神經元較假手術組稀疏且染色淺,芪藶組和纈沙坦組均有改善。ELISA結果發現,模型組大鼠海馬組織Aβ42含量較假手術組明顯升高,芪藶組和纈沙坦組較模型組顯著降低,這與Morris水迷宮實驗中心衰模型大鼠的認知受損結果相一致。因此有一定的理由推測,在AngⅡ影響慢性心衰導致認知功能損害的病理環節中,海馬Aβ42異常增多參與了學習記憶功能的損害。而芪藶強心膠囊可以通過抑制海馬AngⅡ 濃度,降低Aβ42含量,從而改善認知能力。

綜上所述,芪藶強心膠囊在改善慢性心衰大鼠心功能的同時,還能對其認知功能障礙起到一定的治療作用,其機制可能與抑制外周和海馬AngⅡ及腦內Aβ42水平有關,具體仍有待深入研究。