miRNA150-5p在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及診斷價值

李璇 趙雯鈺 郭毅婷 賀亮 李軍紅 張艷芳

1鄭州大學第二附屬醫院，鄭州 450014；2鄭州大學附屬洛陽中心醫院內分泌科，洛陽 471099；3鄭州大學附屬洛陽中心醫院甲乳外科，洛陽 471099；4鄭州大學附屬洛陽中心醫院病理科，洛陽 471099

甲狀腺結節非常普遍，約1/3的人中患有甲狀腺結節，其中5%～15%為惡性結節［1］。近幾十年來，甲狀腺癌（thyroid carcinoma，TC）發病率在我國呈快速上升趨勢，尤其是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）［1-2］。因此，評估甲狀腺結節的性質是一個關鍵的臨床問題。目前，細針穿刺活檢（fine needle aspiration biopsy，FNAB）是甲狀腺結節主要的診斷方法［3］。然而，在20%～30%的病例中，FNAB標本的細胞學發現并不確定［4-5］，使甲狀腺結節的診斷陷入困境。對于無法明確性質的結節，因存在惡性風險，患者多數會接受手術治療。據估計，高達50%的甲狀腺結節手術是不必要的［6］。

研究表明，分子、遺傳以及環境因素等都與TC的發生、發展有關［7-8］。miRNA是一類長度約20個核苷酸的小型非編碼單鏈RNA，可與特定mRNA的3′-非翻譯區（3′UTR）結合，干擾細胞增殖、遷移、凋亡和分化［9］。miRNAs在多種文獻中被提出作為癌癥通路的調控因子，并作為癌癥診斷的預測性生物標志物，包括肺癌、前列腺癌、多發性骨髓瘤等［10-12］。miRNA150-5p被報道可調控多種癌癥的生物學和病理學進程，是細胞生長、轉移和凋亡的重要介質［13-14］。但是，筆者查閱文獻發現，miRNA150-5p在PTC中的表達方式未見報道。

在本研究中，筆者檢測了miRNA150-5p在PTC組織、癌旁組織及良性甲狀腺結節（benign thyroid nodule，BTN）組織中的表達水平，并分析miRNA150-5p鑒別診斷甲狀腺結節性質的臨床價值。

資料與方法

1.研究對象

選擇2021年10月至2022年1月在鄭州大學附屬洛陽中心醫院住院的43例PTC患者和19例BTN患者為研究對象。納入標準：⑴經術后病理檢查明確病理類型；⑵術前未接受放療、化療及免疫治療。排除標準：⑴合并嚴重的肝腎功能不全；⑵合并嚴重的心肺功能不全；⑶合并感染性疾病；⑷合并其他惡性腫瘤。本研究經鄭州大學附屬洛陽中心醫院醫學倫理委員會審核批準，所有患者均簽署知情同意書。

2.臨床資料收集

⑴收集患者一般資料，包括年齡、性別。⑵禁食至少8 h后，早晨用真空采血管采集外周靜脈血8 ml，將血液標本送至檢驗科，由鄭州大學附屬洛陽中心醫院檢驗科工作人員按標準化流程檢測游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）、甲狀腺球蛋白（Tg）、癌胚抗原（CEA）、降鈣素（CT）。⑶甲狀腺超聲檢查由2位具有5年以上經驗的醫師進行。超聲圖像分析結果包括：縱橫比（＜1或≥1）、邊界（清晰或不清晰）、包膜（不受侵犯、受侵犯）、回聲（其他回聲、低回聲）、微小鈣化（無、有）和甲狀腺影像報告與數據系統（TI-RADS）分級（＜4級或≥4級）。

3.RNA提取和定量實時聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）

將腫瘤組織、癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣約2 cm）和良性組織采集在一個2.0 ml的Eppendorf管中，并加入1.5 ml RNAlater液（Invitrogen），然后儲存在-80 ℃。根據制造商的方案，使用RNAiso Plus（Takara）從新鮮組織中提取RNA，并使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（Takara）逆轉錄合成cDNA。U6作為內參基因。將TB Green Advantage RT-qPCR Premix Kit（Takara）用于miRNA150-5p的qRT-PCR。進行3次RT-qPCR，并使用2-ΔΔCt法計算表達水平的變化。內參基因U6正向引物：GGAACGATACAGAGAAGATTAGC，反向引物TGGAACGCTTCACGAATTTGCG。miRNA150-5p引物序列：TCTCCCAACCCTTGTACCAGTG（生工生物工程公司）。

4.統計分析

采用SPSS 24.0軟件和GraphPad Prism 9.0.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩獨立組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，兩配對組間比較應用Wilcoxon符號秩和檢驗；計數資料以率（%）的形式表示，組間比較采用χ2檢驗。采用單因素和多因素logistic回歸模型分析PTC的影響因素。采用受試者工作特征曲線（ROC）分析miRNA150-5p預測PTC的診斷效能，得到ROC下面積（AUC）、靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值及陰性預測值。P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.PTC組和BTN組的臨床資料

PTC組年齡小于BTN組，PTC組TSH水平明顯高于BTN組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。兩組性別和FT3、FT4、TPOAb、TgAb、Tg、CEA、CT水平比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。PTC組縱橫比≥1、邊界不清、包膜受侵犯、TI-RADS分級≥4級的比例明顯高于BTN組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 PTC組與BTN組臨床資料比較

2.miRNA150-5p在PTC組織的表達量低于配對的癌旁組織

miRNA150-5p在PTC組織的表達水平低于配對的癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1A）。癌癥基因組圖譜（TCGA）RNA-Seq數據庫進一步支持了這一觀點：與配對的癌旁組織相比，PTC組織中miRNA150-5p的表達量顯著較低（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 A：miRNA150-5p在PTC及配對癌旁組織中的表達。B：癌癥基因組圖譜RNA-Seq數據庫中miRNA150-5p在PTC及配對癌旁組織中的表達

3.miRNA150-5p在PTC組織中的表達量低于BTN組織

miRNA150-5p在PTC及BTN組織中的相對表達量分別為2.032（0.173，7.329）和13.17（6.031，93.7）；與良性受試者相比，PTC組織中miRNA150-5p表達水平較低，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2A）。為了進一步確定miRNA 150-5p在甲狀腺腫瘤組織中的表達，使用TCGA RNA-Seq數據庫研究了514例PTC和59例正常甲狀腺組織中miRNA150-5p的表達水平；如預期，miRNA150-5p在PTC組織中的表達量顯著低于正常對照組（P＜0.05）（圖2B）。

圖2 A：miRNA150-5p在PTC及BTN組織中的表達。B：癌癥基因組圖譜RNA-Seq數據庫中miRNA150-5p在PTC及正常組織中的表達

4.單因素和多因素logistic回歸模型分析PTC的影響因素

單因素logistic回歸分析顯示，miRNA150-5p表達量、年齡、TSH水平、縱橫比≥1、邊界不清晰、包膜受侵犯和TI-RADS分級≥4級與PTC有關（均P＜0.05），見表2。

表2 43例PTC患者影響因素的單因素分析

將甲狀腺結節的良惡性作為因變量，納入miRNA150-5p表達量、年齡、TSH、縱橫比≥1、邊界不清晰、包膜受侵犯和TI-RADS分級≥4級構建多因素logistic回歸方程，結果顯示，miRNA150-5p表達量是PTC的獨立影響因素，miRNA150-5p表達量越高，發生PTC的風險越小，見表3。

表3 43例PTC患者影響因素的多因素分析

5.miRNA150-5p在PTC中的潛在診斷價值

利用ROC評估miRNA150-5p水平診斷PTC的準確性。ROC下面積（AUC）為0.797（95%CI=0.689～0.905，P＜0.001）。進一步分析發現，miRNA150-5p預測PTC的靈敏度、特異度和準確度分別為67.44%、89.47%和74.19%，陽性預測值和陰性預測值分別為93.55%、54.84%。見圖3、表4。

圖3 受試者工作特征曲線分析miRNA150-5p對43例甲狀腺乳頭狀癌患者的診斷價值

討論

在本研究中，筆者分析了PTC患者的一些臨床特征，結果顯示，與BTN患者相比，PTC患者更年輕，TSH水平更高，這與以往的研究一致［15-16］。Zheng等［17］分析56篇研究發現，PTC患者血清TSH水平明顯高于BTN患者，PTC組血清TSH水平約為BTN組的1.44倍，東亞人為1.39倍，白種人為1.72倍。根據Golbert L等［18］的研究，較高的血清TSH水平與TC風險增加相關，將TSH水平作為甲狀腺惡性腫瘤風險分層的輔助診斷指標可能有助于確定最佳的治療方法。有研究發現，TgAb、TPOAb對惡性甲狀腺結節的檢出率分別為63.64%、62.63%［19］。本研究在PTC患者中發現了較高的TPOAb和TgAb水平，但分析結果顯示兩組之間差異無統計學意義，這一結果可能與樣本量的大小及樣本的入選條件有關，有待進一步研究。根據《2022年甲狀腺癌診療指南》，TC的腫瘤標志物有Tg、CT、CEA。Tg在鑒別甲狀腺結節良惡性方面缺乏特異性，但血清Tg變化可作為判別腫瘤復發和轉移的重要指標。血清中CT和CEA水平變化有助于髓樣癌患者評估療效以及病情監測。甲狀腺結節的超聲惡性征象有縱橫比≥1、邊界不清晰、實性低回聲結節、有微小鈣化、甲狀腺外侵犯等。超聲TI-RADS分級是術前篩查及診斷甲狀腺結節的重要手段之一，TI-RADS分級越高，惡性的概率越大。在本研究中，PTC組中縱橫比≥1、邊界不清晰、包膜受侵犯、TI-RADS分級≥4級的患者的比例明顯高于BTN組。但是，甲狀腺超聲只能初篩甲狀腺結節的良惡性，不能明確診斷，且準確度受醫師經驗的影響。

miRNA對腫瘤的發生、發展有很大的影響，它可以精確地與mRNA結合，在轉錄或轉錄后水平調控靶基因的表達［20］。miRNA具有幾個潛在的優勢，包括易于PCR檢測、相對同質性和高度特異性的表達。研究表明，miRNA在人體內具有組織特異性，有些癌癥會高水平表達miRNA，而有些癌癥則會低水平表達。miRNA150-5p在胃癌、宮頸癌、非小細胞癌中高表達［21-23］，在頭頸部鱗癌、結直腸癌、胰腺癌中低表達［24-26］。在本研究中，筆者使用qRT-PCR檢測了PTC組織、癌旁組織及BTN組織標本中miRNA150-5p的表達水平。本研究數據顯示，與配對癌旁組織和BTN組織相比，miRNA150-5p在PTC組織中的表達明顯降低。為了進一步驗證這一結果，通過分析從TCGA RNA-Seq數據庫獲得的514例PTC組織及59例正常甲狀腺組織基因表達數據集，發現PTC組織中miRNA150-5p的表達量顯著低于正常組織。

鑒于miRNA150-5p在PTC中的表達顯著較低，筆者進一步研究了miRNA150-5p表達與PTC之間的關系。在多因素logistic回歸方程中納入miRNA150-5p表達量、年齡、TSH、縱橫比≥1、邊界不清晰、包膜受侵犯和TI-RADS分級≥4級等變量，miRNA150-5p表達量仍是PTC的一個重要影響因素，miRNA150-5p表達量越高，發生PTC的風險越小，表明它可能對PTC的發生至關重要。miRNA150-5p通過靶向基質金屬蛋白酶14（MMP14）抑制肝癌細胞遷移和侵襲［27］。miRNA150-5p通過抑制TP53抑癌基因促進結腸腺癌增殖［28］。miRNA150-5p在宮頸癌細胞中高表達，通過靶向SRCIN1促進上皮間充質轉化（EMT）和癌細胞的增殖［22］。miRNA150-5p通過靶向Wnt/β-catenin信號通路抑制膠質瘤細胞的增殖［29］。然而，miRNA150-5p影響PTC發生的具體機制尚不清楚，未來需要更多的研究。

近年來，遺傳檢測已成為發展迅速的方法之一，其診斷用途日益增加。miRNA是一種有前途的診斷工具，將miRNA引入PTC診斷程序將提高良性和潛在惡性病變的區分。更詳細地了解PTC發生過程中miRNA的作用機制可能會發現新的潛在醫學靶點，這對于腫瘤的臨床管理尤其重要。筆者利用ROC分析了miRNA150-5p預測診斷PTC的價值：miRNA150-5p的AUC為0.797，特異度、靈敏度和準確度分別為89.47%、67.44%和74.19%；因此，推測其可作為PTC潛在的診斷標志物。miRNA在甲狀腺結節鑒別診斷中的作用已有研究，利用ROC分析miRNA223-5p、miRNA16-2-3p、miRNA152-3p、miRNA34a-5p、miRNA31-5p對甲狀腺癌的診斷價值，其AUC分別為0.720、0.690、0.630、0.604、0.580［30-31］。可以看出，單個miRNA的診斷價值有限；因此，可以將更多的miRNAs聯合應用于PTC的診斷，提高術前PTC診斷的準確度。

綜上所述，miRNA150-5p在PTC組織中顯著低表達，miRNA150-5p在區分PTC患者和BTN患者方面具有良好的診斷性能，有望成為診斷PTC的潛在生物標志物。因此，在臨床實踐中，miRNA可以被認為是一種新的、有前途的、微創的PTC診斷工具。為了進一步驗證miRNA在PTC檢測中的準確性，未來還需要對更大的樣本進行更多的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突