新羌防劑抗流感退熱的藥效機(jī)制探索

賈丹， 張梓佳， 馮毅凡， 李衛(wèi)民， 周欣欣

（1.廣州醫(yī)藥研究總院有限公司，廣東廣州 510000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510060；3.廣東藥科大學(xué)，廣東廣州 510060）

流行性感冒（簡稱“流感”）是由流感病毒（甲型流感病毒、乙型流感病毒等）所引起，以發(fā)熱、頭痛、咳嗽、鼻塞、噴嚏、咽痛、無力等癥狀為主要臨床表現(xiàn)[1]，具有傳染性強(qiáng)、病程較長且發(fā)熱癥狀重的特點(diǎn)。本病當(dāng)歸屬于中醫(yī)學(xué)“外感熱病”“疫病”范疇。新羌防劑處方是北京中醫(yī)藥大學(xué)史利卿教授針對(duì)“外感熱病”，以中醫(yī)起效迅速、療效顯著的“汗法”為治療法則[2-4]，在羌防劑如九味羌活丸、荊防敗毒散等基礎(chǔ)上篩選、合并，組成的中藥復(fù)方制劑，包括野菊花、青蒿、荊芥穗、香薷、羌活、防風(fēng)、蒼術(shù)、胡椒、桂枝、知母、青風(fēng)藤和甘草等12 味藥材，具有祛邪透毒、辛散解表、祛邪解表功效[5-6]。傳統(tǒng)水煎方法對(duì)中藥內(nèi)親脂性的芳香揮發(fā)有效成分提取不完全，且揮發(fā)性成分遇高溫易被分解破壞，而采用超臨界CO2萃取的優(yōu)勢主要是根據(jù)CO2超臨界狀態(tài)的低溫、親脂性特點(diǎn)將組方的芳香揮發(fā)有效成分充分提取[7]。本課題組相關(guān)新羌防劑的研究已取得國家藥監(jiān)局臨床研究受理（受理號(hào)：CXL230005）并申請(qǐng)了處方及工藝專利（申請(qǐng)?zhí)枺?02110862668.7）。本研究是依據(jù)臨床有效處方進(jìn)行的創(chuàng)新中藥新藥研究，主要針對(duì)流感的核心癥狀，開展新羌防劑抗病毒、解熱功效[8-9]解析，進(jìn)行超臨界CO2萃取工藝與水煎工藝的藥效對(duì)比研究，以期為新羌防劑治療流感的新藥開發(fā)提供藥效證據(jù)支持，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物210 只SPF 級(jí)BALB/c 小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量14～16 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]，飼養(yǎng)于湖南省普瑞瑪藥物研究中心有限公司病原微生物實(shí)驗(yàn)室（BSL-Ⅱ），實(shí)驗(yàn)室備案編號(hào)：長衛(wèi)計(jì)實(shí)備字（2021）第B010 號(hào)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2020-0015。276 只SD 大鼠，雌雄各半（雄性：170.0 ～210.0 g；雌性：140.0～180.0 g），購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)藥研究總院有限公司SPF級(jí)動(dòng)物房[SYXK（粵）2018-0003]。動(dòng)物倫理審批單位：廣州醫(yī)藥研究總院有限公司，倫理編號(hào)：IA-PD2020034。

1.2 病毒株H3N2 甲型流感病毒（A/Cakifornia/2/2014），由美國ATCC 提供；乙型流感病毒（ATCCVR-1938），由美國ATCC 提供。以上病毒均在病原微生物實(shí)驗(yàn)室[BSL-Ⅱ，實(shí)驗(yàn)室備案編號(hào)：長衛(wèi)計(jì)實(shí)備字（2021）第B010 號(hào)]培養(yǎng)和擴(kuò)增。

1.3 藥物、試劑與儀器連花清瘟顆粒（北京以嶺藥業(yè)有限公司，批號(hào)：2010027）；磷酸奧司他韋膠囊（宜昌東陽光長江藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：0222001054）；對(duì)乙酰氨基酚片（中美天津史克制藥有限公司，批號(hào)：19080525）；布洛芬顆粒（湖北亨迪藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20210104）。脂多糖（LPS，美國Sigma 公司，批號(hào)：DH183-1）；干酵母（安琪酵母股份有限公司， 批號(hào)：154A202007）。血?dú)馍囗?xiàng)測試卡片（CG4+Cartridge）、i-STAT 300G 血?dú)鈾z測儀（ABBOTT 公司）；MC-3B 電子體溫計(jì)[歐姆龍（大連）有限公司]；URIT-910Cplus 電解質(zhì)分析儀（桂林優(yōu)利特公司）。

1.4 超臨界CO2萃取工藝制備新羌防劑將12 g青風(fēng)藤粉碎為粗粉后與9 g 知母和9 g 甘草混合用70%乙醇回流提取2 次，第1 次為1 h，第2 次為40 min，合并提取物。將野菊花12 g、青蒿12 g、荊芥穗9 g、香薷9 g、羌活9 g、防風(fēng)9 g、蒼術(shù)9 g、胡椒6 g 和桂枝6 g 共9 味藥材混合研磨為20 ～60目粗粉，進(jìn)行超臨界CO2萃取后加入0.35倍95%乙醇作為改性劑，繼續(xù)采用超臨界CO2萃取工藝提取其中的芳香揮發(fā)性成分，55 ～60 ℃低溫濃縮后合并2 次萃取提取物。超臨界CO2萃取工藝參數(shù)為：萃取壓力29 MPa，萃取溫度45 ℃；分離Ⅰ壓力9 MPa，溫度50 ℃；分離Ⅱ壓力5 MPa，溫度35 ℃。萃取1 h。然后將乙醇提取物與萃取提取物混合為新羌防劑。另外，將新羌防劑采用水煎煮方法提取設(shè)置為水煎工藝（CGSN-01）組。

1.5 流感病毒感染小鼠模型實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 分組與給藥 BALB/c 小鼠210 只，按性別和體質(zhì)量隨機(jī)分為8組，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，磷酸奧司他韋膠囊組（0.02 g·kg-1·d-1），連花清瘟顆粒組（0.5 g·kg-1·d-1），新羌防劑低、中、高劑量組[3.6（相當(dāng)于臨床等效劑量）、7.2、14.4 g（生藥）·kg-1·d-1]，CGSN-01對(duì)照組[14.4 g（生藥）·kg-1·d-1]，每組26 只。小鼠給藥劑量均按成人平均體質(zhì)量60 kg 計(jì)，根據(jù)人-小鼠體表面積法換算。各組小鼠按20 mL·kg-1經(jīng)口灌胃給予相應(yīng)濃度的藥液，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積的純水，每日1次，連續(xù)灌胃7 d。

1.5.2 甲型流感病毒或乙型流感病毒感染小鼠模型構(gòu)建 于首次給藥前2 h 采用乙醚輕微麻醉各組小鼠，除正常對(duì)照組外，其他各組小鼠經(jīng)鼻滴入H3N2 甲型流感病毒液含5 個(gè)半數(shù)致死量（5LD50）或乙型流感病毒原液5LD50，100 μL/只，正常對(duì)照組經(jīng)鼻滴入等體積的空白培養(yǎng)基。

1.5.3 樣本采集與檢測方法 ①自感染造模當(dāng)日開始，連續(xù)觀察7 d，記錄各組動(dòng)物體質(zhì)量；②于給藥后24、48 h及給藥后第7天，分別從各組中隨機(jī)選取8、8、10只動(dòng)物，雌雄各半，頸椎脫臼安樂死，解剖取肺臟后稱質(zhì)量，按肺指數(shù)（mg·g-1）=肺濕質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g），計(jì)算肺指數(shù)；③于給藥后24、48 h，分別從各組中隨機(jī)選取8只動(dòng)物，雌雄各半，取肺組織進(jìn)行血凝滴度檢測；④末次給藥后頸椎脫臼安樂死各組剩余小鼠，解剖取肺臟，經(jīng)10%中性福爾馬林灌注固定后，石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，置于光鏡下觀察肺臟組織病理學(xué)變化，從炎性、血性滲出，肺泡上皮細(xì)胞破壞及肺支架塌陷、肺泡炎癥細(xì)胞浸潤方面進(jìn)行評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]如下：無異常，計(jì)為0 分；輕度，計(jì)為1 分；中度，計(jì)為2 分；重度，計(jì)為3分。將每只動(dòng)物各項(xiàng)評(píng)分累加進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 發(fā)熱大鼠模型實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 LPS 誘發(fā)大鼠發(fā)熱模型 將檢疫合格SD 大鼠進(jìn)行體溫測定，剔除連續(xù)2次體溫均值偏差較大的動(dòng)物。將篩選后的動(dòng)物按體溫、性別，隨機(jī)均衡分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，新羌防劑低、中、高劑量組[0.40（相當(dāng)于臨床等效劑量）、0.80、1.60 g（浸膏）·kg-1·d-1]，連花清瘟顆粒組（1.62 g·kg-1·d-1），對(duì)乙酰氨基酚片組（0.045 g·kg-1·d-1）、CGSN-01 對(duì)照組[1.83 g（浸膏）·kg-1·d-1]，每組10 只，雌雄各半。大鼠給藥劑量均按成人平均體質(zhì)量60 kg 計(jì)，根據(jù)人-大鼠體表面積法換算。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日進(jìn)行肛溫測定，每只SD 大鼠測定體溫2 次，取其平均值作為基礎(chǔ)體溫。測量完成后，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠于頸背部皮下注射LPS 溶液（劑量150 μg·kg-1，注射體積2 mL·kg-1）；正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水。LPS注射造模后即刻灌胃給藥。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積純水灌胃。于給藥后1、2、3、4、5、6、7、8 h 測量各組大鼠的肛溫，以基礎(chǔ)體溫為基線，計(jì)算給藥后1 ～8 h各組大鼠體溫的變化值[11-13]。

1.6.2 干酵母誘發(fā)大鼠發(fā)熱模型 將檢疫合格的SD 大鼠進(jìn)行體溫測定，剔除連續(xù)2 次體溫均值偏差較大的動(dòng)物，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和造模組。正常對(duì)照組皮下注射冰凍無菌生理鹽水，造模組皮下注射20%干酵母生理鹽水混懸液10 mL·kg-1，造模后每小時(shí)測量體溫，直腸溫度上升1 ℃以上為造模成功[10-12]。將造模組大鼠根據(jù)肛溫均衡隨機(jī)分為模型對(duì)照組，新羌防劑低、中、高劑量組[0.40（相當(dāng)于臨床等效劑量）、0.80、1.60 g（浸膏）·kg-1·d-1]，連花清瘟顆粒組（1.62 g·kg-1·d-1），對(duì)乙酰氨基酚片組（45 mg·kg-1·d-1）以及CGSN-01 對(duì)照組[1.83 g（浸膏）·kg-1·d-1]，每組14 只，雌雄各半。分組后立即灌胃給藥，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積純水灌胃。給藥后1、2、3、4、5、6 h 測量大鼠肛溫，以基礎(chǔ)體溫為基線，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)每組大鼠的體溫變化值。末次體溫測量后，將大鼠深度麻醉，腹主動(dòng)脈采血，應(yīng)用血?dú)夥治鰞x檢測動(dòng)脈血液pH、動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PCO2）、動(dòng)脈血氧分壓（PO2）、動(dòng)脈血氧飽和度（SO2）。

1.7 對(duì)大鼠腸系膜微循環(huán)作用影響的實(shí)驗(yàn)方法

1.7.1 分組與給藥 將84只檢疫合格SD 大鼠（雌雄各半）按體質(zhì)量、性別隨機(jī)分為正常對(duì)照組，新羌防劑低、中、高劑量組[0.40（相當(dāng)于臨床等效劑量）、0.80、1.60 g（浸膏）·kg-1·d-1]，連花清瘟顆粒組（1.62 g·kg-1·d-1），布洛芬顆粒組（0.054 g·kg-1·d-1），CGSN-01 對(duì)照組[1.83 g（浸膏）·kg-1·d-1]。每組12 只，雌雄各半。

1.7.2 檢測方法 各組大鼠根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)定進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)給藥3 d。末次灌胃給藥1 h 后，迅速腹腔注射大鼠體質(zhì)量5%體積的熒光素鈉注射液，2 s 內(nèi)快速推入，于注射后5、15、30、45、60 min頸總靜脈取血。血液樣本以3 000 r/min離心（離心半徑100 mm）15 min，低溫避光環(huán)境下分離血漿，590 nm 波長處測定吸光度（OD）值。繪制熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線公式計(jì)算各組大鼠靜脈中的熒光劑含量，分析熒光素鈉的濃度變化以反映血液體微循環(huán)速度[14-15]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。先進(jìn)行組間方差分析（F-test），符合正態(tài)分布與方差齊，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）或雙因素方差分析（Twoway ANOVA）分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新羌防劑改善流感病毒感染模型小鼠的感染癥狀

2.1.1 體質(zhì)量 表1 結(jié)果顯示：于給藥后第2 ～5 天，與正常對(duì)照組比較，H3N2 甲型流感病毒感染的模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，連花清瘟顆粒組給藥后第2 天體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05），新羌防劑中劑量組給藥后第3 ～5 天體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。提示H3N2 甲型流感病毒感染造成小鼠體質(zhì)量下降，新羌防劑可緩解小鼠感染后的體質(zhì)量下降。

表1 新羌防劑對(duì)H3N2甲型流感病毒感染小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of Xinqiangfang Agent on body mass in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s，鼠數(shù)=26只）

表1 新羌防劑對(duì)H3N2甲型流感病毒感染小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of Xinqiangfang Agent on body mass in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s，鼠數(shù)=26只）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型對(duì)照組比較

?

表2結(jié)果顯示：于給藥后第2 天，乙型流感病毒感染的模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量較正常對(duì)照組顯著下降（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，各給藥組小鼠給藥第1 ～7 天體質(zhì)量均無顯著改善（P＞0.05）。

表2 新羌防劑對(duì)乙型流感病毒感染小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effect of Xinqiangfang Agent on body mass in mice infected with influenza B virus（±s，鼠數(shù)=26只）

表2 新羌防劑對(duì)乙型流感病毒感染小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effect of Xinqiangfang Agent on body mass in mice infected with influenza B virus（±s，鼠數(shù)=26只）

注：①P＜0.01，與正常對(duì)照組比較

?

2.1.2 肺指數(shù) 表3 結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠感染H3N2 甲型流感病毒后24 h、48 h、7 d 肺指數(shù)均顯著增大（P＜0.05 或P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，磷酸奧司他韋膠囊組、連花清瘟顆粒組和新羌防劑低、中、高劑量組小鼠給藥后48 h 肺指數(shù)均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），至給藥后第7 天，磷酸奧司他韋膠囊組、連花清瘟顆粒組和新羌防劑中、高劑量組小鼠肺指數(shù)仍顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 新羌防劑對(duì)H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺臟指數(shù)的影響Table 3 Effect of Xinqiangfang Agent on indexes of lungs in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s）

表3 新羌防劑對(duì)H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺臟指數(shù)的影響Table 3 Effect of Xinqiangfang Agent on indexes of lungs in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型對(duì)照組比較；⑤P＜0.01，與CGSN-01對(duì)照組比較

?

表4結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠感染乙型流感病毒后24 h、48 h、7 d 肺指數(shù)均顯著增大（P＜0.01）。給藥后24 h，磷酸奧司他韋膠囊組、連花清瘟顆粒組和新羌防劑低、高劑量組肺指數(shù)較模型對(duì)照組均顯著減小（P＜0.05或P＜0.01）；給藥后48 h，磷酸奧司他韋膠囊組肺指數(shù)較模型對(duì)照組顯著減小（P＜0.05）；給藥后第7 天，與模型對(duì)照組比較，磷酸奧司他韋膠囊組，連花清瘟顆粒組，新羌防劑低、中、高劑量組，CGSN-01 對(duì)照組肺指數(shù)均顯著減小（P＜0.01）。提示新羌防劑能顯著抑制小鼠感染H3N2甲型流感病毒后的肺部病變，且在同等劑量下，新羌防劑藥效優(yōu)于CGSN-01。

表4 新羌防劑對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺臟指數(shù)的影響Table 4 Effect of Xinqiangfang Agent on indexes of lungs in mice infected with influenza B virus （±s）

表4 新羌防劑對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺臟指數(shù)的影響Table 4 Effect of Xinqiangfang Agent on indexes of lungs in mice infected with influenza B virus （±s）

注：①P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對(duì)照組比較；④P＜0.01，與CGSN-01對(duì)照組比較

?

2.1.3 肺內(nèi)血凝效價(jià) 表5 結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組H3N2 甲型流感病毒感染后24、48 h 血凝效價(jià)顯著增加（P＜0.01）。給藥后24 h，磷酸奧司他韋膠囊組，連花清瘟顆粒組，新羌防劑中、高劑量組，CGSN-01 對(duì)照組血凝效價(jià)均顯著降低，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；給藥后48 h，磷酸奧司他韋膠囊組，連花清瘟顆粒組，新羌防劑低、中及高劑量組血凝效價(jià)均顯著降低，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表5 新羌防劑對(duì)H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺內(nèi)血凝效價(jià)的影響Table 5 Effect of Xinqiangfang Agent on Hemagglutination titer in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s，鼠數(shù)=8只）

表5 新羌防劑對(duì)H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺內(nèi)血凝效價(jià)的影響Table 5 Effect of Xinqiangfang Agent on Hemagglutination titer in mice infected with H3N2 influenza A virus（±s，鼠數(shù)=8只）

注：①P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對(duì)照組比較；④P＜0.05，與連花清瘟顆粒組比較；⑤P＜0.05，⑥P＜0.01，與CGSN-01對(duì)照組比較

?

表6結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組乙型流感病毒感染24、48 h 后血凝效價(jià)顯著增加（P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，給藥后24、48 h，磷酸奧司他韋膠囊組，連花清瘟顆粒組，新羌防劑低、中、高劑量組，CGSN-01 對(duì)照組血凝效價(jià)均顯著減小（P＜0.05 或P＜0.01）。提示新羌防劑能顯著抑制小鼠感染H3N2 甲型流感病毒和乙型流感病毒后的肺中病毒效價(jià)。

表6 新羌防劑對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺內(nèi)血凝效價(jià)的影響Table 6 Effect of Xinqiangfang Agent on Hemagglutination titer in mice infected with influenza B virus（±s，鼠數(shù)=8只）

表6 新羌防劑對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺內(nèi)血凝效價(jià)的影響Table 6 Effect of Xinqiangfang Agent on Hemagglutination titer in mice infected with influenza B virus（±s，鼠數(shù)=8只）

注：①P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型對(duì)照組比較

?

2.1.4 肺組織病理學(xué) 表7、圖1結(jié)果顯示：正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊；模型對(duì)照組可見肺泡間隔增寬，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤。與正常對(duì)照組比較，模型小鼠H3N2 甲型流感病毒感染第7 天肺組織評(píng)分顯著增加（P＜0.05）。于給藥后第7 天，磷酸奧司他韋膠囊組，連花清瘟顆粒組和新羌防劑中、高劑量組肺組織病變較模型對(duì)照組均有不同程度的減輕。

圖1 新羌防劑給藥后第7天對(duì)H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺臟組織病理學(xué)形態(tài)的影響（HE染色，×100）Figure 1 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathologic features of lung tissue in mice infected with H3N2 influenza A virus on day 7 after administration（HE staining，×100）

表7 新羌防劑給藥后第7天對(duì)H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺臟病理變化評(píng)分的影響Table 7 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathologic scores of lungs in mice infected with H3N2 influenza A virus on day 7 after administration（±s，鼠數(shù)=8只）

表7 新羌防劑給藥后第7天對(duì)H3N2甲型流感病毒感染小鼠肺臟病理變化評(píng)分的影響Table 7 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathologic scores of lungs in mice infected with H3N2 influenza A virus on day 7 after administration（±s，鼠數(shù)=8只）

注：①P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；②P＜0.05，與模型對(duì)照組比較

?

表8、圖2 結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠乙流病毒感染第7天肺臟病變?cè)u(píng)分顯著增加（P＜0.05）；于給藥后第7 天，磷酸奧司他韋膠囊組、連花清瘟顆粒組和新羌防劑低、中、高劑量組肺部病變?cè)u(píng)分均顯著降低，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 新羌防劑給藥后第7天對(duì)乙型流感病毒感染小鼠組織病理學(xué)形態(tài)的影響（HE染色，×100）Figure 2 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathology of lungs in mice infected with influenza B virus on D7 after administration（HE staining，×100）

表8 新羌防劑給藥后第7天對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺臟病理變化評(píng)分的影響Table 8 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathologic scores of lungs in mice infected with influenza A virus on day 7 after administration（±s，鼠數(shù)=8只）

表8 新羌防劑給藥后第7天對(duì)乙型流感病毒感染小鼠肺臟病理變化評(píng)分的影響Table 8 Effect of Xinqiangfang Agent on histopathologic scores of lungs in mice infected with influenza A virus on day 7 after administration（±s，鼠數(shù)=8只）

注：①P＜0.01，與正常對(duì)照組比較；②P＜0.05，與模型對(duì)照組比較

?

2.2 新羌防劑具有顯著的解熱藥效

2.2.1 LPS 誘導(dǎo)發(fā)熱的大鼠模型 圖3 結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，LPS 造模后1 h 動(dòng)物體溫開始上升，造模2 h 后與空白對(duì)照組比較有顯著差異（P＜0.05），5 h 到達(dá)發(fā)熱高峰（P＜0.01），并穩(wěn)定持續(xù)至造模后8 h。與模型對(duì)照組比較，對(duì)乙酰氨基酚片組給藥后2 ～8 h、連花清瘟顆粒組給藥后4 ～8 h，新羌防劑低劑量組給藥后3 ～7 h、新羌防劑中劑量和高劑量組給藥后1 ～8 h、CGSN-01對(duì)照組給藥4 ～5 h 體溫均顯著降低。新羌防劑解熱藥效呈顯著的量-效關(guān)系。同時(shí)，在同等臨床擬用劑量的等效劑量下，新羌防劑低劑量解熱藥效的起效時(shí)間早于連花清瘟顆粒；同等臨床擬用劑量4 倍劑量下，超臨界CO2萃取的新羌防劑解熱效果優(yōu)于水煎新羌防劑。

圖3 各組大鼠肛溫與造模前比較結(jié)果熱圖（±s，℃；鼠數(shù)=10只）Figure 3 Heat map of anal temperature results for each group of rats compared to pre-modelling（±s，℃；10 mice）

2.2.2 干酵母感染誘導(dǎo)發(fā)熱的大鼠模型 圖4、表9結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，干酵母誘發(fā)發(fā)熱造模后5 h 模型對(duì)照組大鼠平均體溫上升超過1.2 ℃，并穩(wěn)定維持發(fā)熱狀態(tài)至造模后11 h，pH、PCO2、PO2、SO2值均無顯著性差異（P＞0.05）。連花清瘟顆粒組給藥后6 h 體溫顯著低于模型對(duì)照組，血液SO2（%）水平高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。對(duì)乙酰氨基酚片組于給藥后1 h 體溫即顯著降低，血液pH 值升高、血液PCO2（%）水平降低（P＜0.01）。新羌防劑低劑量組給藥后4、6 h 體溫顯著低于模型對(duì)照組，血液PO2和SO2（%）含量高于模型對(duì)照組（P＜0.05）；新羌防劑中、高劑量組給藥后1 ～6 h 體溫均顯著低于模型對(duì)照組，且藥效穩(wěn)定；新羌防劑高劑量組血液PCO2含量顯著降低，血液pH 值升高，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明新羌防劑解熱藥效呈顯著的量-效關(guān)系，同等臨床擬用量等效劑量下，新羌防劑解熱起效時(shí)間、藥效持久性以及對(duì)血氧的改善作用均優(yōu)于連花清瘟顆粒組。新羌防劑解熱藥效持久性優(yōu)于對(duì)乙酰氨基酚片。同等臨床擬用量4 倍給藥劑量下，超臨界CO2萃取的新羌防劑解熱效果優(yōu)于水煎新羌防劑。

圖4 各組大鼠肛溫與造模前比較結(jié)果熱圖（±s，℃；鼠數(shù)=14只）Figure 4 Heat map of anal temperature results for each group of rats compared to pre-modelling（±s，℃；14 mice）

表9 干酵母感染誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)熱模型血氧檢測結(jié)果Table 9 Blood oxygen assay results in a dried yeast infection-induced fever model（±s，鼠數(shù)=10只）

表9 干酵母感染誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)熱模型血氧檢測結(jié)果Table 9 Blood oxygen assay results in a dried yeast infection-induced fever model（±s，鼠數(shù)=10只）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，與模型對(duì)照組比較

?

2.3 新羌防劑具有顯著促進(jìn)大鼠腸系膜微循環(huán)速度的藥效圖5 結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，新羌防劑加速大鼠腸系膜微循環(huán)系統(tǒng)對(duì)腹腔內(nèi)熒光素鈉注射液的吸收速率。正常對(duì)照組熒光素鈉檢測峰值在注射后60 min，新羌防劑低、中、高劑量組熒光素鈉檢測峰值分別出現(xiàn)在45 min、15 min、15 ～30 min，以此推測新羌防劑具有加速腸系膜微循環(huán)速度的功效，其藥效強(qiáng)度與給藥劑量呈現(xiàn)出較好的量-效關(guān)系。陽性對(duì)照藥布洛芬顆粒給藥后熒光素鈉檢測峰值提前至15 min。同等臨床擬用劑量的4 倍劑量下，超臨界CO2萃取的新羌防劑加速腸系膜微循環(huán)系統(tǒng)吸收速率的功效優(yōu)于水煎新羌防劑。

圖5 各時(shí)間點(diǎn)靜脈血中熒光素鈉含量檢測結(jié)果熱圖（±s，鼠數(shù)=12只）Figure 5 Heat map of sodium fluorescein results in venous blood at various time points（±s，12 mice）

3 討論

新羌防劑是北京中醫(yī)藥大學(xué)史利卿教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)確定的處方，并經(jīng)多年的臨床驗(yàn)證對(duì)流感有效后進(jìn)行的復(fù)方中藥新藥開發(fā)。有研究按照流感處方組成進(jìn)行藥材提取工藝設(shè)計(jì)，采用超臨界CO2萃取提取處方中藥材的有效物質(zhì)芳香揮發(fā)性成分，經(jīng)對(duì)10 個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)性成分如胡薄荷酮、麝香草酚、香荊芥酚、桂皮醛、胡椒堿、異歐前胡素、蒼術(shù)素等進(jìn)行分析，指出超臨界CO2萃取提取效率明顯優(yōu)于水煎工藝[16]。超臨界的低溫、親脂性特點(diǎn)較適合于解表中藥復(fù)方中芳香揮發(fā)有效成分的提取。本研究采用超臨界CO2萃取工藝，將新羌防劑的有效成分（芳香揮發(fā)性成分）充分提取，加強(qiáng)對(duì)風(fēng)寒濕之邪的“透”和“解”，達(dá)到快速解除風(fēng)寒濕之邪所致的高熱、惡寒等癥狀[17]，類似中醫(yī)“汗法”。

本研究分別采用H3N2 甲型流感病毒和乙型流感病毒感染BALB/c 小鼠，建立小鼠呼吸道感染模型，通過觀察模型小鼠的一般生理狀態(tài)、肺指數(shù)、肺內(nèi)血凝效價(jià)及肺組織炎癥狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)新羌防劑提取物具有顯著抗呼吸道病毒性感染的藥效。解熱實(shí)驗(yàn)分別采用了體內(nèi)注射脂多糖（LPS）、干酵母建立發(fā)熱動(dòng)物模型[12]。在此研究的基礎(chǔ)上確認(rèn)了新羌防劑具有快速且顯著的解熱效果，并在抗病毒感染、解熱藥效方面具有顯著的量效關(guān)系。

在對(duì)腸系膜微循環(huán)系統(tǒng)的研究中，通過分析腹腔熒光素鈉吸收速率，發(fā)現(xiàn)新羌防劑可顯著改善流感病毒引發(fā)的肺部感染及LPS和干酵母感染誘發(fā)的動(dòng)物發(fā)熱癥狀，改善干酵母發(fā)熱模型血氧濃度的降低，明顯加速腸系膜對(duì)熒光素鈉的吸收速度，其藥效強(qiáng)度與給藥劑量呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。結(jié)果亦提示羌防劑類抗流感中藥快速透毒、退熱的內(nèi)在作用機(jī)制與其加速機(jī)體血液微循環(huán)、促“發(fā)汗”的功效密切相關(guān)。

新羌防劑的特點(diǎn)是采用了超臨界CO2萃取工藝。本研究采用超臨界CO2萃取工藝提取的新羌防劑的藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)水煎提取物。傳統(tǒng)水煎提取物雖有明確的臨床療效，但其整體療效不如超臨界CO2萃取物。對(duì)新羌防劑、中藥對(duì)照藥、化藥對(duì)照藥進(jìn)行藥效對(duì)比，結(jié)果表明：采用超臨界CO2萃取工藝同等劑量（或低于臨床所需用量）的新羌防劑的抗病毒感染、解熱、加速微循環(huán)速度等作用顯著優(yōu)于常規(guī)水煎工藝、已上市中成藥和化藥。

綜上所述，新羌防劑對(duì)流感病毒感染引發(fā)的相關(guān)癥狀如發(fā)熱等臨床核心癥狀具有快速退熱作用，顯著優(yōu)于常規(guī)水煎工藝、已上市中成藥和化藥，其顯著的起效迅速的藥效與應(yīng)用超臨界CO2萃取工藝密切相關(guān)。