PCR 技術及其在食品微生物檢測中的應用

徐知明

（深圳市通量檢測科技有限公司，廣東深圳 518102）

與其他食品微生物檢測領域所應用的檢測技術相比，基于PCR 的檢測技術具有較高的精確度與可靠性，有利于食品微生物檢測工作的開展。PCR 技術在食品微生物檢測中的應用能更加快速且真實地了解食品中的致病菌情況，評估病原微生物類型，為后續相關工作的開展奠定基礎[1]。更為關鍵的是，通過對PCR 技術的合理應用，能夠準確推斷食品在生產后階段內微生物的繁殖量以及繁殖速度，從而使食品安全檢查工作的開展更具預見性與針對性[2]。以下就PCR 技術在食品微生物檢測領域中的應用進行分析。

1 PCR 技術

PCR 技術應用于食品微生物檢測過程中，通過高溫變性 低溫退火 中溫延伸的方式，完成對食品樣本微生物核酸序列的檢測，并進行核酸擴增反應。對于被檢測食品樣品而言微生物處于雙鏈狀態的DNA 序列于94.0 左右的高溫狀態下進行變性反應，并以雙鏈的方式存在，在高溫變性基礎之上，55.0 左右時特異性引物與模板DNA 單鏈互補序列配對結合；72.0 左右，以被檢測食品樣品微生物引物的引導延伸為基礎進行復制處理，并實現對微生物DNA 序列的檢測。在PCR 檢測過程中，上述反應反復發生，最終獲取充足的被檢樣品中微生物DNA 序列，從而得出準確的檢測結果。

目前，PCR 技術在食品微生物檢測中的應用以熒光定量PCR 技術為主，該技術在檢測過程中通過對微生物基因的標記來分析DNA 數量。為確保熒光定量PCR 技術在微生物檢測領域得到可靠應用，就需要高度重視受體發色團偶極-負極間的相互關系，并通過能量轉移的方式，使供體發色基因-受體發色基因在熒光表現上呈現出較強的差異，在此基礎上使DNA 產生數量與熒光強度呈正相關。具體操作中，檢測人員需要對靶序列初始濃度進行準確記錄，根據參與反應熒光濃度的實測值得到準確的檢測結論。相關報道中指出，PCR 熒光定量技術能夠準確反映出待測食品樣品中所含微生物，同時掌握基因標記與基因復制的相關內容。這樣一來，即便食品樣品中所含微生物數量有限，仍然可以通過對初始濃度進行標記與記錄的方式獲取可靠的檢測結果。且相較于其他檢測技術，基于熒光定量的PCR 技術在具體實施中有較高的自動化水平，檢測結果準確性高，整個操作過程簡單可控，對我國當前的食品環境市場而言有較高的適用性。

2 基于PCR 技術的食品微生物檢測方法

PCR 技術在食品微生物檢測領域中的應用相當普遍，PCR 技術的合理應用為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及綠膿桿菌等食品領域常見微生物檢測提供了可能性[3]。以金黃色葡萄球菌為例，該菌種在新鮮蔬果中的繁殖速度非常快，尤其是對于存放有一定時間的蔬果，表面金黃色葡萄球菌的繁殖速度極快，其代謝產物腸毒素會對人體產生非常大的影響，甚至可能導致食物中毒事件的發生。因此，在食品微生物檢測中必須高度重視對該指標的檢測，科學確定該菌種以及類似菌種的分布情況，最大限度排除其對人體安全所產生的不利影響。而在這一背景下， PCR 技術能夠實現對被測食品樣品中微生物的可靠檢測，保障檢測精度符合要求。食品生產企業可以嘗試將基于PCR 技術的微生物檢測引入產品出廠檢驗環節，避免不合格食品流入市場。所涉及的微生物檢測方法有以下幾種類型。

2.1 普通PCR 檢測方法

普通PCR 檢測法是食品微生物檢測中應用最為廣泛的檢測方案。檢測期間，將一定比例聚合酶添加至混合物中，可形成檢測所需的基礎樣本。后續檢測期間，還應當對反應條件以及環境溫度進行預設，并展開針對基礎樣本的處理反應。在溫度可控的條件下，混合物由于添加有一定比例的聚合酶，容易導致目標物質產生擴增反應[4]。基礎樣本檢測期間高溫變性是指在加熱條件下，經過一段時間模板DNA解離成為易與引物結合的單鏈；低溫退火為DNA 片段成單鏈后降溫，引物與模板DNA 單鏈的互補序列配對結合；延伸為DNA 模板-引物結合物在經聚合酶的作用，按堿基互補配對與半保留復制原理，復制DNA。上述3 個過程可不斷重復，得到更多的半保留復制鏈，為下次復制過程提供模板。上述循環過程反應迅速，2 ～3 h 可得到幾百萬條DNA，以滿足食品檢測需求。

2.2 多重PCR 檢測方法

多重PCR 檢測技術是以常規PCR 檢測方法為基礎進行改進與優化所得。常規PCR 檢測方法從本質上來說是基于單引物的檢測，而多重PCR 檢測技術則實現了對多個DNA 引物的檢測。對于相同的PCR 反應體系，通過投加≥2 個反應引物的方式，受聚合酶影響產生擴增與復制。需要注意的是，本方法用于微生物檢測時，反應前投加2 個或2 個以上DNA 引物，因而在聚合酶作用下能夠生成多個相對應的DNA 反應片段，在應用于食品微生物檢測中時，能夠就微生物的致病因子展開系統分析[5]，這對于微生物檢測結果準確率的提升是非常關鍵的。且本方法實施過程中所分析致病因子明顯較傳統方法更多，檢測效率較高。目前，多重PCR 檢測技術能夠縮短檢測時間、減少檢測內容遺漏風險，促進檢測結果準確率的提升，且對樣本投入量有一定的控制效果，可通過多基因檢測的方式獲得較高的經濟效益。

2.3 定量PCR 檢測方法

定量PCR 檢測技術是在常規PCR 檢測方法的基礎上變形得到，操作原理及步驟上與傳統PCR 方法存在一定差異，但將其應用于食品微生物檢測中時能夠表現出突出的優勢。應用本方法檢測食品樣本中微生物的基本原理是對細胞組織中總DNA進行提取，將mRNA 作為檢測模板，選擇隨機引物并通過逆轉錄酶反應的方式轉錄形成cDNA。在此基礎上，形成cDNA 模板并對其進行擴增處理，以此種方式獲得檢測基因及其表達。相較于傳統的PCR 檢測技術，定量PCR 檢測技術嘗試將待檢測食品樣本目標中的一條RNA 先進行逆轉錄處理，得到互補DNA，使后續的擴增以及復制處理具有針對性。為確保檢測結果的可靠性，在本檢測方法實施期間必須注意確保參與逆轉錄反應的DNA 模板的完整性，且剔除其他蛋白質或雜質的影響，保障基因鏈的完整性。本檢測方法可以嘗試與數字技術以及熒光技術相結合，提高檢測過程的靈敏度，以便獲取更高精準度的檢測結果。

3 PCR 技術在食品微生物檢測中的應用

近年來，PCR 技術已經在食品微生物檢測領域得到廣泛應用，在食品致病菌、乳酸菌以及水源細菌的檢測等環節中發揮出了一定的優勢。

3.1 食品致病菌檢測

以往針對食品致病菌展開的檢測手段存在一系列問題，檢測過程耗時長且操作步驟煩瑣，難以保障檢測工作的開展效率。且為得到可靠的檢測結果，常需要對被檢測微生物進行富集培養處理，確保食品檢測樣品中微生物數量達到可供檢測水平后方可進行樣品微生物分離處理，進而對微生物具體形態特征進行鑒定。由此可見，傳統檢測方法不但需要人工進行微生物培養，且培養期間不確定因素較多，導致微生物檢測難度較大。而PCR 技術的應用能夠突破傳統檢測技術存在的諸多限制，通過對細菌編碼rRNA 進行擴增以及賦值處理的方式，獲取微生物致病菌檢測所需的DNA 片段，并能全面了解致病菌的存在情況。除此以外，基于PCR 技術的應用還能夠對難以進行人工培養的微生物進行擴增處理，獲取準確的DNA 片段，從而得到可靠的檢測結果。

3.2 水源指示細菌檢測

水質同樣會對人們的身體健康產生影響，食品行業大量產品對水質要求較高，對水源指示細菌進行檢測有重要價值。以往針對水質的細菌檢測以大腸埃希菌為關鍵指標，使用傳統檢測方法需要幾天時間，耗時耗力，且檢測結果的準確性難以保障。若能夠通過利用 -半乳糖苷酶的方式，明確底物并進行檢測，則能夠顯著提高檢測結果的準確性與工作效率。但需要注意的是，部分大腸桿菌品系對 -葡萄糖醛酸苷酶的表達效果較差，難以保障檢測結果的可靠性。而PCR 技術可以面向 -半乳糖苷酶以及 -葡萄糖醛酸苷酶基因提供更加可靠與有效的檢測方案，相較于傳統方法具有更強的靈敏度以及特異性，且能夠在檢測過程中進行擴增處理，以實現對多種類型大腸桿菌的可靠檢測，同時縮短檢測時間，提高檢測效率。以沙門氏菌為例，其作為寄生在人類以及動物腸道組織中的典型微生物，屬于革蘭氏陰性桿菌，生化反應與人體抗原結構存在密切關系。若不及時發現水源污染并進行針對性處理，可能導致一系列疾病的產生。需要注意的是，沙門氏菌雖然毒性水平偏低，但在菌體裂解反應過程中會產生毒性水平較高的內毒素，并侵入宿主細胞，進而對人體健康產生影響。目前PCR 技術的應用過程中，有關沙門氏菌的檢測可以將invA、invb、hila以及16S rRNA 作為主要靶基因。

3.3 乳酸菌檢測

以典型的雙歧桿菌為例，有研究嘗試對雙歧桿菌現有種以及相關種所對應基因序列進行對比分析，結果顯示位于1 412 ～1 432 位的寡核苷酸堿基序列有高度一致性表現，提示其可以作為雙歧桿菌特異性較高的寡核苷酸片段，通過對PCR 技術的應用，可以將其作為引物并對雙歧桿菌16S rRNA 基因片段進行擴增處理。在此過程當中，模板DNA 通過簡單SDS 裂解細菌細胞并經蛋白酶對蛋白進行去除處理后獲得。在這一背景下，雙歧桿菌能夠基于PCR 技術進行擴增處理的方式產生具有典型特征的1.35 kb核苷酸片段，并以其為基礎展開PCR 檢測，確保檢測結果的可靠性。

4 結語

在食品安全領域中，對食品微生物進行可靠檢測是非常重要的工作內容，在此期間應用PCR 技術的綜合優勢非常明顯。在PCR 技術的應用過程中，相關人員必須形成正確的技術應用認知，結合微生物檢測實際需求制定完善的PCR 技術方案，并通過有效措施促進食品微生物檢測工作質量的提高，將PCR 技術作用充分發揮出來，根據微生物檢測結果及時發現食品安全問題并積極展開后續應對與處理工作。本文通過分析PCR 技術在食品微生物檢測中的應用及相關原理介紹，希望為食品質量安全的保障奠定基礎。