基于AFLP分子標記的鴨綠江茴魚遺傳多樣性分析

閆春梅 高春山 鄭偉 王秀蘭 劉長有 金香琴

(吉林省水產科學研究院,吉林長春 130033)

鴨綠江茴魚(Thymallusarcticusyaluensis)隸屬于鮭形目、茴魚科,主要分布于吉林省鴨綠江流域,分布區域狹小,群體間不存在地理隔離[1]。該魚肉質細嫩,營養豐富,經濟價值極高,是優質名貴珍稀魚類。受諸多因素影響,近年來鴨綠江茴魚資源嚴重衰退,已被列為國家Ⅱ級保護動物[2]。自2013年開始,孫鍇等[3]、王秀蘭等[4]、曹永芬等[5]分別在鴨綠江茴魚人工繁殖及成魚養殖方面進行了科學研究,突破了鴨綠江茴魚人工養殖的技術瓶頸。馬波等[6]、劉云國等[7]和Sun等[8]相繼應用線粒體D-loop基因序列分析法和微衛星標記法對茴魚群體結構進行了系統分析,更加精確地分析了茴魚的群體遺傳結構,為茴魚種質資源分析及保護夯實了基礎,也為茴魚人工增殖放流提供了科學依據。但關于鴨綠江茴魚群體遺傳多樣性及遺傳結構研究至今鮮有報道。

本研究將擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)方法應用于鴨綠江茴魚群體遺傳多樣性研究中,利用AFLP標記高度的靈敏性、較好的重復性和豐富的信息量等優勢,分析并探討鴨綠江茴魚群體遺傳結構及群體種質資源現狀,以支持鴨綠江茴魚資源可持續利用研究的穩步開展,為資源的長期開發利用提供重要的數據資料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用鴨綠江茴魚采捕自吉林省內各江段,其中鴨綠江上游采捕48尾,松花江上游采捕24尾;臨江金鯊養殖場采集18尾,共計90尾。

PCR相關試劑購自TaKaRa公司;引物、AFLP試劑盒、DNA提取試劑盒及其他試劑均購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 DNA提取

DNA提取按照離心柱型動物組織基因組DNA提取試劑盒的方法進行。提取的DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和濃度后,于4 ℃保存備用。

1.3 AFLP分析

參照AFLP試劑盒的說明方法進行AFLP反應,并適當優化反應條件。

1.3.1 酶切連接

采用一步法進行酶切連接反應,接頭引物序列詳見表1。具體反應體系(20 μL)如下:10×Reaction buffer 2.5 μL,10 mmol/L ATP 2.5 μL,Adapter 1 μL,EcoR I/MseI 2 μL,T4 Ligase 1 μL,模板DNA 4 μL(50 ng/μL),AFLP-Water 7 μL。混勻后瞬時離心,37 ℃ 5 h,8 ℃ 4 h,4 ℃保存過夜。

表1 AFLP接頭及預擴增引物序列

1.3.2 預擴增

預擴增采用25 μL反應體系,具體配比如下:10× PCR buffer 2.5 μL,預擴增引物(EcoR I/MseI 50 ng/μL等比混合)1 μL,dNTPs 1 μL,TaqDNA polymerase(2 U/μL) 0.5 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 18 μL。混合均勻后瞬時離心,94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s,30個循環;72 ℃延伸5 min。

1.3.3 選擇性擴增

以預擴增產物1∶20稀釋后作為選擴模板。選擇性擴增為25 μL反應體系,具體配比如下:10× PCR buffer 2.5 μL,EcoR I 引物(共8種) 1 μL,MseI 引物(共8種) 1 μL,dNTPs 0.5 μL,TaqDNA polymerase 0.5 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 17.5 μL。混勻后瞬時離心。94 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s,以后每輪循環溫度遞減0.7 ℃,擴增12輪。接著按94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s擴增23輪。選擇性擴增引物序列見表2。

表2 選擇性擴增引物序列

1.3.4 AFLP圖譜分析

AFLP多態性分析采用ABI 377測序儀進行。

1.4 數據分析

利用GENESCAN 3.1提取數據,利用Binthere軟件提取樣品片段大小。利用Excel軟件進行數據統計01矩陣處理,將不為0的數值轉換為1,數值0不變,生成由0和1組成的原始矩陣。利用Popgen 32軟件分析位點總數、多態性位點、多態性位點頻率、觀測等位基因數、有效等位基因數、Nei’s多樣性指數、Shannon’s信息指數等遺傳學數據。利用NTSYSpc-2.11F軟件對原始矩陣求DICE相似系數矩陣。用SHAN程序中的UPGMA方法進行聚類分析,并通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結果

2.1 AFLP選擇性擴增結果

篩選多態性好且條帶清晰的EcoR I和MseI引物組合8對,對90尾茴魚進行了AFLP分析,結果見表3。8組引物共擴增出2 670個位點,其中多態性位點2 466個,多態性位點比例為92.4%。其中,引物組合E10M6多態性位點比例最高,達到99.4%;引物組合E3M7多態性比例最低,為84.0%。

表3 8組引物的多態性分析

2.2 遺傳多樣性分析

利用Popgen 32軟件分析3個群體90尾鴨綠江茴魚的遺傳多樣性,結果見表4。其中E10M6引物組合的各項參數值均最高,觀測等位基因數(Na)為1.708 3,有效等位基因數(Ne)為1.257 0,Nei’s多樣性指數(H)為0.160 4,Shannon’s信息指數(I)為0.256 2。3個群體比較,鴨綠江上游群體的各項參數值均最高,Na為1.340 9,Ne為1.153 8;H為0.093 2,I為0.144 7;臨江群體次之,松花江上游群體各項參數值均最低。

利用Popgen 32軟件分析3個茴魚群體的遺傳分化情況,結果見表5。8對引物組合的遺傳分化系數(Gst)為0.176 7～0.254 7,其中E10M6值最大,E6M5值最小,表明8對引物組合在3個群體間的遺傳分化占總群體雜合度的17.67%～25.47%。3個群體的平均Gst值為0.219 4,表明3個群體間發生了一定程度的分化。其中,松花江上游群體與臨江群體間平均Gst值為0.232 2,松花江上游群體與鴨綠江上游群體間平均Gst值為0.186 6,鴨綠江上游群體與臨江群體間平均Gst值為0.094 3,可見任意兩個群體間均發生了中等程度以上的遺傳分化。

表5 3個鴨綠江茴魚群體間的遺傳分化系數

通過分析DICE相似系數矩陣,90尾茴魚的遺傳相似性為0.820 6～0.936 3。其中,3個群體內遺傳相似性分別為:鴨綠江上游群體0.832 2～0.936 3,平均0.895 9;松花江上游群體0.879 6～0.931 7,平均0.900 9;臨江群體0.855 3～0.910 3,平均0.881 6。利用8對引物對3個鴨綠江茴魚群體進行UPGMA聚類分析,結果顯示,3個茴魚群體中,松花江上游群體單獨聚為一支,鴨綠江上游群體和臨江群體出現聚群情況。

圖1 3個鴨綠江茴魚群體系統進化樹

3 討論

遺傳多樣性(genetic diversity)又稱基因多樣性,是指種內基因的變化,包括種內顯著不同的種群間和同一種群內的遺傳變異。AFLP是一種基于PCR反應選擇性地擴增限制片段的方法,根據特異片段或多態位點的頻率或遺傳相似性可進行遺傳多樣性及遺傳分化等研究。本研究主要是對吉林省鴨綠江茴魚群體進行種群內的遺傳變異分析。從多肽位點比例(PPL)、觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s多樣性指數(H)、Shannon’s信息指數(I)、總群體雜合度(Ht)、亞群體雜合度(Hs)、遺傳分化系數(Gst)和群體遺傳相似性等幾個遺傳多樣性分析常用指標,對分別采捕(采集)自鴨綠江上游、松花江上游以及臨江金鯊養殖場的共計90尾鴨綠江茴魚的鰭條樣本進行了AFLP遺傳多樣性分析。

3.1 鴨綠江茴魚遺傳多樣性水平分析

鴨綠江茴魚分布于鴨綠江上游及其支流水系中,其分類學地位一直存有爭議[1]。2011年,孫家賢等[9]對黑龍江茴魚、下游黑龍江茴魚及黑龍江上游呼瑪河流域北極茴魚等3種茴魚的遺傳多樣性進行了微衛星比較分析,確定3種茴魚遺傳多樣性水平很高,種間產生了顯著的遺傳分化,并支持3種茴魚在屬內各為獨立種的分類學地位。Koskinen等[10]、Stamford等[11]利用微衛星分子標記和mtDNA-RFLP標記分別研究了歐洲和美洲不同茴魚群體的地理遺傳結構及親緣關系。Froufe等[12]、Weiss等[13]和馬波等[6]利用線粒體D-loop區DNA序列分析了不同茴魚群體的分子進化關系。但關于鴨綠江茴魚遺傳多樣性水平的分析研究國內尚未見相關報道。大規模的群體遺傳分析是更好地保護茴魚群體資源的重要手段和方法。本研究利用AFLP方法,對吉林省內鴨綠江茴魚3個群體進行了遺傳多樣性水平分析,共篩選出8組多態性好且條帶清晰的引物,對90尾茴魚DNA樣本進行PCR擴增,總計擴增出2 670個位點,其中多態性位點2 466個,多態性位點的比例高達92.4%,顯著高于福建近海竹莢魚閩東和閩南群體(63.28%、61.89%)[14]及廣東省吉富羅非魚群體(87.17%)[15],可見本研究中90尾鴨綠江茴魚遺傳多態性較高。究其原因,可能是本研究采集的鴨綠江茴魚大多數來自野生環境,且采自不同地域,這也表明吉林省內茴魚種質資源質量較好。

本研究對3個鴨綠江茴魚群體進行了遺傳結構及遺傳變異分析,Na、Ne、H、I這4個指標的結果顯示,鴨綠江上游群體各項值均最高,分別為1.340 9、1.153 8、0.093 2、0.144 7;臨江群體次之,松花江上游群體各項值最低。篩選出8組引物對3個群體的90尾鴨綠江茴魚進行PCR擴增,計算結果,Na為1.251 7～1.340 9,Ne為1.130 0～1.153 8,H為0.078 2～0.093 2,I為0.119 8～0.144 7,這與吉林省雜色杜父魚野生群體的測量值相當(Na為1.203 7～1.316 6,Ne為1.111 9～1.151 7,H為0.067 0～0.091 2,I為0.102 0～0.141 0)[16],而略低于翹嘴紅鲌太湖野生群體(Na為1.579 9,Ne為1.385 9,I為0.322 1)[17],可見本研究采集的90尾鴨綠江茴魚個體間存在一定的遺傳變異,對環境的適應性為中等。

3.2 鴨綠江茴魚遺傳結構分析

遺傳分化系數度量的是群體間的基因多樣性。Wright[18]認為,當群體之間的遺傳分化處于中等程度時,遺傳分化系數通常在0.05～0.15。本研究利用Ht、Ns及Gst指標值對3個鴨綠江茴魚群體的遺傳分化情況進行分析,Gst平均值為0.219 4,這與條斑星鰈引進群體的Gst值相近(0.219)[19],而高于福建近海竹莢魚閩東和閩南群體(0.044 3)[14]。表明本研究3個鴨綠江茴魚群體之間的遺傳分化程度很高。

遺傳相似性及UPGMA聚類分析結果顯示,3個群體90尾鴨綠江茴魚個體的遺傳相似性較高,為0.820 6～0.936 3,遺傳距離較小。通過系統進化樹明顯看出,松花江上游群體單獨聚為一支,鴨綠江上游群體和臨江群體聚為一支,表明3個群體間出現了較高程度的分化,這與遺傳分化系數顯示的結果相一致。