給水系統微生物檢測方法的比較

許 皓,趙 蓓,李相宜,尚風雷,焦復燃

(北京市自來水集團有限責任公司,北京市供水水質工程技術研究中心,北京 100031)

飲用水安全與人類健康息息相關。在2003年世界環境日的致辭中,時任聯合國秘書長的科菲·安南指出全世界80%的疾病和50%的兒童死亡都與飲用水水質不良有關,并強調水在人類生存和可持續發展中的核心作用。世界衛生組織于2017年制定的Guidelinesfordrinking-waterquality:Fourtheditionincorporatingthefirstaddendum[1]中指出,保證飲用水微生物安全在于找到方法防止或減少病原體進入水源,并減少對去除病原體的處理過程的依賴。該報告同時指出,飲用水微生物衛生安全除了與糞便污染有關,還會受到生長在供水管網中部分微生物(如軍團菌)的影響。此外,還有研究[2]表明自來水廠某些處理過程存在微生物泄漏風險。隨著飲用水水質標準的不斷嚴格,水廠微生物安全性和風險管控的需求都提高到新的水平。

部分基于培養的傳統微生物檢測方法存在不準確、時效性不高等缺點,無法滿足全面、深入的微生物檢測需求。因此,選擇適合的微生物檢測方法,實現對給水系統中微生物快速、準確地檢測,并能夠進一步深入開展微生物溯源尤為重要。本文通過總結基于傳統培養、生物化學和分子生物學的3類檢測方法,綜合對比其優缺點和應用特性,為從源頭到龍頭全供水過程的微生物安全保障提供參考。

1 基于培養的傳統方法

傳統的培養方法大多依賴于直接觀察培養微生物的生理行為。

飲用水微生物檢測中,異養菌平板計數(heterotrophic plate count, HPC)即根據以有機碳源為營養源的培養基檢測到的微生物計數,描述所有異養菌數量的方法[3],其作為傳統的指示菌檢測手段于一個多世紀前提出[4]。該方法現多用于檢測水中的細菌總數,在國內外飲用水水質監測指標中均有規定相應的培養時間、溫度及檢出限值,與總大腸桿菌群一起作為衡量消毒效果的指標[5]。

根據配方不同,HPC培養基多為傳統營養瓊脂培養基(PCA)、貧營養培養基(R2A)、高營養的5%羊血瓊脂培養基(TSA-SB)等[3]。弧菌、埃希氏菌、沙門氏菌、氣單胞菌、彎曲桿菌、志賀氏菌等存活但不能檢出或生長相對緩慢的細菌,使用PCA的HPC結果被證明低于水體中實際細菌總數[6]。同時,也有人認為使用PCA檢測得到的細菌代表著可快速生長的細菌,當存在糞便污染時可能與大腸菌群和腸道病原體一起出現[7]。R2A營養成分較PCA豐富且含量低,適合產色素菌生長,更適合對飲用水中細菌的檢測[8]。

根據接種方法的不同,HPC可分為倒平板(pour plate, PP)法、涂布(spread plate, SP)法和濾膜(membrane filter, MF)法,3種方法的優缺點對比如表1所示[7]。

表1 HPC不同接種方法優缺點Tab.1 Advantages and Disadvantages of Different Vaccination Methods of HPC

綜上,HPC的優點是成本低廉、操作較簡單,且對操作人員的專業水平要求較低,是國內較普遍使用的方法。但具有較多缺點:(1)HPC檢測到的總細菌群落比例通常低于飲用水中實際比例[4],該方法除了無法檢測飲用水中部分“存活但不可培養”的細菌和生長相對緩慢的細菌外,還無法檢測死亡的細菌;(2)可檢測最大樣品量受限;(3)不同的培養基、培養溫度、培養時間對細菌數量和種群影響大[4];(4)培養用時長,需要一天至幾天,無法滿足快速檢測需求[9];(5)部分接種方式對操作環境要求嚴格。

R2A多用于檢測飲用水、顆粒活性炭(granular activated carbon, GAC)、管道內壁生物膜、無損反滲透膜內異養菌的數量[6]。美國在檢測供水管網消毒劑效果時,使用PP法加PCA在(35±0.5)℃和(48±2)h的條件下進行檢測,來排除高HPC結果對總大腸桿菌檢測的影響。若無消毒劑殘留,則規定HPC小于500 CFU/mL的檢出限值。當用低營養介質的培養基檢測到較高數量的細菌時,一些美國自來水公司將其作為水質變化的敏感指標,可能代表氯胺消毒的水存在硝化問題,或次氯酸鈉消毒的水存在消毒劑殘留量不足等問題[7]。MF法可測定樣品體積靈活,但受限于濾膜孔徑,適合檢測渾濁度較低的樣品。HPC可用于檢測飲用水水源水的污染[10-12],評價水處理過程中生物穩定性和活性,探究水質指標對生物穩定性的影響,評估各處理單元效率效果[13-17],還可用于評價配水管網中的生物穩定性[16,18-23]。

2 基于生物化學的微生物檢測方法

基于生物化學的方法是利用微生物體中不同分子的結構和功能特性,通過特異的生化反應或生物分子特征檢測微生物的方法,包括固定底物酶底物法(defined substrate technology, DST)、流式細胞術(flow cytometry, FCM)和三磷酸腺苷(ATP)生物發光法。

2.1 DST

DST是傳統的鑒別培養基的一種應用。根據微生物的代謝特點,利用生物化學反應的原理,在培養基中加入某種指示劑或化學藥品,一般可直接測定某種微生物的種類。在飲用水檢測中,該方法多應用于總大腸菌群和嗜肺軍團菌的檢測[24]。

DST的優點在于假陽性/陰性的發生率比一般酶底物法低,且檢驗周期短[25]、靈敏度高、操作流程簡單[24]。DST和基于最可能數法(MPN)建立的Colilert?-QuantiTray聯合方法(IDEXX, Chalfont St. Peter, UK)對培養的環境、設施和人員要求也更低[26]。該方法已列入《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》(GB/T 5750.12—2006)[27]。但是,目前DST所需檢測試劑為國外進口,價格較高,可能限制該方法的使用。

在實際應用中,大腸菌群產生的特異性酶可以分解培養基中的色原底物,使培養液呈黃色。檢測大腸桿菌可以通過其產生的特異性酶使培養基出現熒光反應[25],或使用伊紅-美藍試劑使大腸桿菌出現深紫色且帶有金屬光澤的特征反應。DST除了可檢測總大腸菌群和埃希氏菌,還可實現大量樣品中糞大腸菌群[28-30]、嗜肺軍團菌[31-32]、銅綠假單胞菌[33]、腸球菌[34]等特定菌種的快速檢測,并能在無法保證無菌的環境下使用[24],適用于應急污染事故的快速評價。

2.2 FCM

FCM是一種基于特定細胞亞群的熒光或光散射特性,利用激光測量分析液相中懸浮細胞或微粒的技術。該技術多用于水中細菌總數的檢測。

FCM的優點在于較傳統方法耗時短、誤差小、靈敏度高,可用于區分活菌和死菌,并獲得活菌百分比,適用于各類水質檢測[35]。劉曉露[9]、沈朕等[36]證明了FCM在微生物應急快速檢測中有較高的可信度。

在實際應用中,FCM可用于分析水源水中水生生物信息,對病毒、細菌、藻類進行計數分類、活性鑒定和功能檢測,達到快速區別不同水源水、識別實際操作中的異常值[37-38]、描述水源水中微生物實時波動的目的[11]。通過追蹤細胞損傷動力學、微生物水動力學和細菌細胞總數評估過濾單元、消毒單元[39]的效率和效果[17,37,40-43],評估工藝段是否能有效控制由水源水波動引起的微生物波動[11],監控微生物穩定性[16,44-46],用于水廠微生物水質檢測系統預警[41]。在管網中,FCM可有效用于檢測追蹤微生物的再生,識別可能的污染源,分析細菌再生的原因[47-51],也可分析建筑物中水停滯后微生物群落的變化[52]。該技術的突出應用是在微生物全自動在線檢測系統的建設和水污染事件快速響應機制的建立方面[53],例如,Hammes等[54]建立了將流式檢測和數據分析結合起來的自動檢測系統,Besmer等[10]也研究了長期使用FCM系統檢測飲用水處理流程和水源水的系統。

2.3 ATP生物發光法

ATP是僅出現在活細胞內的基礎能量單位,其數量與細菌數成正比。該方法基本原理是利用熒光素酶試劑對活細胞進行標記,利用生物發光儀檢測發出的熒光[9]。優點在于檢測時間短、操作簡單;缺點在于靈敏度和準確性不高、反應體系的最佳條件未知,并且難以消除天然水體中細胞及游離ATP對結果的干擾[55]。

ATP生物發光法雖然只能判斷微生物的數量和活性,但對污染或微生物入侵的敏感性較高,多與其他特異性檢測方法搭配使用,用于水源水中檢測菌落總數[55-58];監測水廠出現污染的緊急狀況[59],檢測細菌群落豐度,建立各類模型[60-62];檢測判斷管網生物穩定性的影響因素[16,23,63]。在在線監測系統中與FCM或作為細菌指示劑與基于微流體的系統相配合,可實現快速實時監測[64]、篩選特定微生物、監測飲用水污染[65-66]的作用,并起到預警作用[67]。

3 基于分子生物學的方法

基于分子生物學的方法依賴于對DNA和RNA研究技術的進步,包括基于聚合酶鏈式反應(poly-merase chain reaction,PCR)技術的方法、指紋圖譜法、基于高通量測序(high-throughput sequencing, HTS)技術的方法。

3.1 基于PCR技術的方法

3.1.1 PCR

PCR是一種體外快速擴增特異性核酸片段的技術,于1983年由Mullis等[68]提出并迅速投入試驗。其原理是以人工合成的核苷酸序列為引物,在DNA聚合酶的作用下,通過反應溫度的變化,對目的基因進行指數擴增,從而特異性地擴增目標細菌特定基因片段[9]。

PCR分析具有較高的特異性、靈敏度和重復性,檢測耗時較短[9],但最大缺點是不能區分病原體的活性。PCR分析是基于完整的核酸,而不是完整的活細胞,因此,病原菌PCR擴增陽性可能來自死亡細胞或非感染性細胞的假陽性[69]。同時,該技術無法對起始模板準確定量,只能通過電泳對擴增反應的最終產物進行定性[70]。

3.1.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)與常規PCR相比可以實現定量分析,具有更好的特異性、靈敏度和自動化程度,同時可以解決PCR污染的問題[9],是目前應用最廣泛的PCR技術。根據qPCR所用熒光化學物質的不同,可分為熒光染料和熒光探針2類[70]。

熒光染料SYBR Green Ι與dsDNA的結合具有非特異性,可能使試驗產生假陽性結果,因此,其特異性不如探針法[71]。但此檢測方法較為簡單,成本較熒光探針更低。

熒光探針TaqMan具有高度特異性[72]。與熒光染料相比,探針法的特異性節省了時間,敏感性、特異性、穩定性更高,但其缺點是仍無法區分細菌的活性[9]。

3.1.3 數字PCR

數字PCR(digital PCR, dPCR)屬于第3代PCR,最早出現于1999年[73]。相較于qPCR,dPCR能夠直接讀出DNA分子的個數,是一種對起始樣品核酸分子的絕對定量技術。該方法的優點是使得該技術能夠檢測野生型序列背景中的罕見突變,還能降低樣本中抑制劑對結果的干擾[74]。

由于能有效進行樣本劃分和單分子目標擴增,dPCR在理論上優于qPCR,但在實踐中,因qPCR具有更高的靈敏度,其在特定應用方面仍優于dPCR[74]。

表2總結對比了3代PCR技術的特點[75]。

表2 3代PCR技術特點對比Tab.2 Comparison of Three Generations of PCR Technologies

PCR對特定檢測目標,如致病性大腸桿菌和“兩蟲”[76-78]的檢測,有比較深入而廣泛的研究[79-82]。PCR技術可檢測水源水、水處理各單元和管網中的特定條件致病菌,并能精確到屬水平,對給水系統的微生物風險管控提供建議[83-87]。新建立的多重PCR檢測技術可一次性同時檢測多種致病菌[88-89]和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs),為飲用水中ARGs和潛在抗性致病菌的風險防控提供理論指導[90],評估管網管材腐蝕與微生物群落間的聯系[91]。

3.2 指紋圖譜法

3.2.1 梯度電泳技術

梯度電泳技術按發展時間可分為變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)。DEEG可靠性高、重現性好、操作簡便、樣品分析量大,且可以實現微生物的時空變化檢測[92]。缺點是其僅能檢測環境中占總量1%以上的微生物[93],分離片段有長度限制[92],不同序列的DNA分離效果不佳[94-95],也不能區分微生物活性[96]。

3.2.2 多態性分析技術

限制性片段長度多態性分析(restriction fragment length polymorphisms, RFLP)是以分子雜交為基礎的分子標記,于1974年創立,被稱為第一代分子標記技術,優點是帶型清楚[96]。單末端標記限制性片段長度多態分析(T-RFLP)根據16S rRNA設計引物,在引物末端使用熒光標記,其優點在于結果更可靠、分析迅速、結果輸出形式便利[97]。單鏈構象多態性分析(single-strand conformation polymor-phism, SSCP)也是以PCR為基礎的分子標記技術[92],利用單鏈核酸因結構和構象不同在電泳中遷移速率不同做多態性分析。

指紋圖譜法常與基于PCR技術的方法聯合使用。國內外學者應用PCR-DGGE進行微生物污染溯源[98-99]、群落結構及多樣性變化分析[100-102]等方面的研究;利用疊氮溴化乙錠(EMA)-PCR方法檢測飲用水中食源性致病菌活菌[103]。SSCP可研究地表水水庫不同溫度中細菌群落結構和組成的季節動態[104]。

3.3 基于HTS技術的方法

HTS技術也被稱為下一代測序技術(next generation sequencing, NGS)。與第一代DNA測序技術(sanger sequencing)相比,NGS技術大幅降低和縮短了測序的難度和時長,可大規模并行分析、通量高、成本低[105]。限制在于讀長短,不能超過500 bp。表3中對比了目前NGS 最具代表性的3個測序技術[105]。

表3 NGS技術對比Tab.3 Comparison of NGS Technologies

在實際應用中,HTS技術常基于16S rRNA,或配合PCR技術應用于水源水水質對微生物群落的影響[107-108]和多樣性的檢測[106];研究工藝段細菌群落及對管網出水的影響[109-111];研究消毒劑對微生物群落的影響[112];研究供水管網中微生物特性[113]、生物膜種群結構[114-116];研究不同水源和處理工藝對管網生物膜微生物群落的影響[117-118];研究不同水力水文條件(輸送距離[119]、水齡和管道材料[120-121]、水力狀況[122])對細菌群落的影響;對水源、工藝、管網的細菌群落進行時空分布分析[123]和溯源追蹤[124];檢測水處理和管網中抗生素耐藥基因(ARGs)[125]。

4 檢測方法對比

上述3類檢測技術綜合對比如圖1所示,其中,深色單元格多代表該技術限制/不足較多,淺灰色單元格多代表該技術短板較少,DST、FCM、ATP和HTS是使用中各方面限制較少也較常用的檢測方法。

圖1 三大類檢測技術對比Fig.1 Comparison of Three Kinds of Detected Methods

日常檢測中,水廠需及時掌握各工藝流程微生物狀況或估算微生物再生能力時,可選擇HPC、DST、FCM,其中DST和FCM對操作人員和環境的要求都不高,檢測速度快,且因DST特異性高,可以滿足重點關注致病菌和指示菌的檢測,與FCM配合可達到準確量化的目的。應對水質突發污染事件檢測時,可選擇FCM、PCR、ATP,其中ATP對不同水源識別和污染入侵敏感,可及時檢測到異常并發出預警,PCR配合ATP能定性分析污染來源和類別,協助制定解決方案。需監測水處理工藝和管網中微生物穩定性、開展水質風險評估、研究可改進工藝時,可按需求和實際情況選擇多種檢測方法聯合進行。

5 結論

(1) 各個檢測方法的特點和性質決定其適用于不同檢測目的,應用實際中較少出現單獨使用一種方法的情況,多采用不同方法相互配合。

(2) 隨著“智慧水務”概念的推廣實踐,越來越多基于實時、在線的計算機技術被引入水務行業,水廠工藝和輸水管網微生物方面的智能化和自動化管理也將得到更廣泛應用。特別是HTS、快速檢測技術的發展,大量研究證實了其可靠性和準確度,如何進一步將這些技術發展和應用,實現高效、實時、準確地在線監測和建立預警系統是下一步的研究方向。

(3)基于新技術在飲用水微生物方面的研究成果,在規劃水廠的建立和處理工藝時,全流程微生物安全應納入考慮,在水廠運行制度中也需加入科學、精準的微生物安全風險預警措施,提升水廠水質生物安全保障能力。