基于SPRi 技術和分子對接探析人參皂苷與MAPK 信號通路的相互作用

張駱琪，李 森，崔如意，杜 霞，5，陳 鴻，王 猛，許海玉*

（1.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；2.中國科學院遺傳與發育生物學研究所，北京 100101；3.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；4.中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700；5.陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710003）

癌癥是由基因突變引起不受調節的細胞過度增殖的疾病，是全球第二大死亡原因。2012 年全球新發癌癥病例為1 410 萬例，預計在2030 年癌癥發病高達2 170 萬例［1］。抑制癌癥發展，減少高發病率的重要策略之一是靶向癌癥的藥物。癌癥的發生、發展與細胞增殖、凋亡等途徑密切相關。因此，細胞周期調控因子和凋亡刺激因子是開發潛在抗癌藥物的重要靶點。

MAPK 通路（RAS-RAF-MEK-ERK） 是關鍵的細胞內信號通路，參與調節細胞增殖、細胞周期、細胞存活、血管生成、細胞遷移等過程［2-3］。通過抑制MAPK 通路的異常激活，會減少癌細胞增殖、侵襲能力及生長，促進癌細胞凋亡［4-5］。目前臨床上針對作用于MAPK 通路針對癌癥的抑制劑基本上是化學合成藥物，例如vemurafenib、dabrafenib、trametinib 等［6］。價格昂貴、不良反應大、且容易產生耐藥性。

人參皂苷是一種固醇類天然產物，是人參、西洋參、三七等人參屬藥材的主要活性成分［7-8］。研究表明，人參等藥材在抗癌作用顯著，且減輕化療、放療的不良反應，提高患者的生活質量［8-9］。對其活性成分人參皂苷的作用機制進行研究迫在眉睫。

人參皂苷種類繁多，作用靶點廣，實驗驗證藥效周期長，消耗經費巨大。通過分子對接技術預測活性成分-蛋白相互作用，分析構效關系［10］。結合SPRi 技術高通量篩選，分析分子相互作用［11］。能夠快速篩選出最有希望的小分子進行實驗。

因此本研究運用分子對接技術研究人參皂苷與MAPK通路相互作用的潛在機制，構建“成分-靶點蛋白” 網絡模型，利用SPRi 技術篩選與核心靶點ERK1 結合的人參皂苷類成分，并進一步通過分子對接技術確定其結合位點。

1 材料

1.1 儀器 PCR 擴增儀 （北京東勝科技有限公司）；Superdex 200 increase 分子篩（美國GE Healthcare 公司）；Kx5 Sinstrument SPRi 儀（美國Plexera 公司）。

1.2 試劑 ginsenoside Rb1、ginsenoside Rb2、ginsenoside Rg1、ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、ginsenoside Re、ginsenoside Rd 等27 個小分子（成都曼思特生物科技有限公司）；限制性核酸內切酶AscI、NotI、T4 DNA Ligase （美國NEB 公司）；Trans-T1 感受態細胞、BL21 （DE3） 感受態細胞、pET-24-2-his 質粒（北京全式金生物技術有限公司）。引物合成及測序由北京擎科生物科技股份有限公司完成。

2 方法

2.1 分子對接

2.1.1 小分子準備 小分子結構來源于PubChem 數據庫（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／） 和ECTM 數據庫（http：／／www.tcmip.cn／ETCM／index.php／Home／Index／），使用Chem3D 19.0 軟件構建小分子3D 結構的MOL2 格式文件，并將MOL2 格式文件轉化為AutoDock Vina 分子對接（http：／／vina.scripps.edu／） 可識別的PDBQT 格式文件。

2.1.2 靶點蛋白準備 通過KEGG 數據庫及相關文獻收集ERK 通路的相關蛋白［12］，從RCSB PDB 數據庫 （www.rcsb.org） 獲得ERK 通路中關鍵蛋白的晶體結構。AutoDock 軟件對蛋白結構進行優化，添加缺失氫原子，減去多余水分子。

2.1.3 確定活性口袋及分子對接步驟 根據文獻報道以及PyMOL 1.8.6 軟件插件GetBox Plugin 確定蛋白分子的活性口袋（表1）。AutoDock Vina 和Python 腳本進行高通量分子對接。以結合能作為評價函數，分析小分子與蛋白的最佳結合方式。PyMOL 可視化小分子和蛋白結合模式，并分析關鍵結合位點。

表1 靶點蛋白活性口袋

2.1.4 人參皂苷與蛋白作用網絡的構建 采用Cytoscape 3.7.2 軟件構建人參皂苷與靶點蛋白互作的網絡模型。

2.2 制備ERK1 蛋白

從表1可以看出，廣西金融術語的翻譯過于放在字面的翻譯，而忽略了實際的意義體現。但是，縱觀后期的金融翻譯，廣西金融翻譯也出現了采用香港金融翻譯的現象。[4]

2.2.1 構建原核表達載體 根據NCBI 收錄的人ERK1 基因的CDS 序列和原核表達質粒（pET-24-2-his） 酶切位點設計引物，利用高保真DNA 聚合酶進行PCR 擴增，獲得帶有酶切位點的ERK1 基因CDS 序列，用AscI、NotI 限制性內切酶對PCR 產物和質粒在37 ℃、90 min 條件下進行酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并純化回收；純化回收的ERK1 片段和質粒片段在16 ℃下通過T4 DNA 連接酶連接120 min；連接產物通過熱激法轉入Trans-T1 感受態細胞內，37 ℃培養12～16 h，挑選單菌落，并進行菌液PCR 篩選陽性克隆，測序驗證。選取序列完全正確的菌液進行質粒提取，提取后的質粒通過熱激法轉入原核表達細菌BL21（DE3） 中，選取陽性克隆進行后續蛋白表達。

2.2.2 重組蛋白誘導表達 重組質粒轉化菌在含Kan 抗性的LB 培養液中進行培養，當菌液OD600nm為0.6～0.8 時，調整溫度為17 ℃，加入IPTG 終濃度為0.4 mmol／L，誘導蛋白表達16 h。在4 ℃下4 500 r／min 離心10 min，收集菌體。每1 g 菌體中加入5 mL 破菌buffer （50 μL 蛋白酶抑制劑、50 μL 10 mg／mL 溶菌酶、25 μL DNaseI），混勻，冰浴30 min。使用高壓細胞破碎儀，在4 ℃下破碎4 次。在4 ℃下12 000 r／min 離心40 min，收集上清與沉淀。

2.2.3 蛋白純化 用鎳柱粗純化，將提取的粗蛋白上清與平衡好的beads，4 ℃結合60 min。15 mmol／L 咪唑洗脫，待洗脫液與G250 考馬斯亮藍溶液反應不發生顏色變化時，則停止用該梯度咪唑溶液洗脫。通過相同步驟，依次用50、100、150、250 mmol／L 咪唑洗脫，收集洗脫液。

利用superdex 200 increase 分子篩柱純化蛋白。吸取樣品進入進樣環；pump path 改為inject，洗脫2 mL 時，將pump path 改為load，25 mL 洗脫。體積流量0.4 mL／min；壓力2 MPa。根據蛋白峰圖，收集樣品。通過SDS-PAGE 法鑒定純化的蛋白為單一條帶，見圖1。

2.3 SPRi 分析小分子與ERK1 蛋白的相互作用 參照Plexera 相關標準流程，通過SPRi 分析儀分析ERK1 和人參皂苷的相互作用。人參皂苷均用DMSO 配制濃度為20 mmol／L 的母液，ERK1 蛋白母液用含有150 mmol／L NaCl 的50 mmol／L Tris-HCl （pH＝8.0） 緩沖溶液分別稀釋為0.5、1.0、5.0 μmol／L。選擇3D UVC 芯片，將5 mg／mL 人參皂苷種植于芯片表面，點樣濕度＜45%，溫度20 ℃，真空干燥，進行光交聯反應。

3 結果

3.1 分子對接 通過AutoDock Vina 進行分子對接，分析27 種人參皂苷與靶點蛋白的相互作用，以Binding Energy 作為考察小分子配體與蛋白受體結合的指標，結合能小于-1.2 kcal／mol或者小于-5 kJ／mol，則認為小分子與蛋白可以結合。選擇結合能最低、小分子結構最舒展的結合構象作為分子對接的結果，人參皂苷與靶點蛋白結合能匯總見表2。

表2 人參皂苷與靶點蛋白對接的結合能

篩選結合能小于-1.2 kcal／mol 的小分子-靶點蛋白繪制人參皂苷-靶點蛋白網絡，見圖2。由此可知，人參皂苷與MAPK 信號通路的相互作用存在1 個化合物作用于多靶點，也有多個化合物調控1 個靶點的情況，這體現了中藥多成分、多靶點協同調控的特點。

圖2 人參皂苷-MAPK 通路蛋白靶點網絡

通過結合能高低分析這27 種人參皂苷成分與MAPK 信號通路上靶點蛋白的結合，發現27 種人參皂苷中，有21種人參皂苷成分與ERK1 的結合能低，例如ginsenoside Rh2、ginsenoside Rb3、ginsenoside CK 等。因此，選擇通過SPRi 實驗對這21 種人參皂苷與ERK1 靶點蛋白的結合作用進行研究。

圖3 SPRi 檢測ERK1 蛋白與7 種人參皂苷的結合能力

表3 ERK1 蛋白與7 種人參皂苷結合的動力學、親和力參數

3.3 人參皂苷人參皂苷與ERK1 蛋白結合可視化 基于SPRi 結合結果，通過PyMOL 軟件對 （20R）-ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、pseudoginsenoside Rh2 等7 種人參皂苷與ERK1 蛋白的分子對接進行可視化，見圖4，并對人參皂苷與蛋白的結合作用進一步分析，發現人參皂苷與ERK1結合的主要位點是Lys71、Glu88、Asp184。人參皂苷與ERK1 蛋白分子對接能和結合位點匯總結果見表4。

圖4 人參皂苷與ERK1 蛋白分子對接圖

表4 人參皂苷與ERK1 蛋白分子對接能和結合位點

4 討論

隨著科技的進步，癌癥的治療手段多種多樣，包括化療、手術、放療等等，但癌癥愈后差、復發概率高、死亡率高，靶向抑制劑為癌癥的治療提供了更多的選擇。已經有多項研究表明MAPK 通路在各種癌癥中的作用，針對MAPK 通路篩選靶向抑制劑的開發已經取得了令人鼓舞的成果。但這些抑制劑主要作用于是RAF （vemurafenib、dabrafenib、encorafenib） 和MEK （trametinib、binimetinib、cobimetinib），關于ERK 的抑制劑很少［13］。

ERK1 在MAPK 通路上處于獨特位置，其上游分子RAF 除了MEK 外幾乎沒有其他效應子，而MEK 除了ERK沒有其他底物；下游通路中，ERK 是唯一能夠刺激多種下游底物的激活劑［14-16］。抑制ERK1 活性能夠逆轉上游突變引起的MAPK 通路的異常激活，靶向ERK1 抑制劑在MAPK 信號通路異常導致的癌癥治療中起重要作用。目前關于ERK1 的抑制劑處于不同的臨床試驗階段，ulixertinib（BVD-523）、GDC-0994、ASN007 等，然而這些抑制劑的缺點也是顯而易見的，它們的作用有限，抑制劑僅對少數特定的癌癥類型有效，因此，篩選新型的ERK 抑制劑是很有價值的研發方向。

人參皂苷具有廣泛的生物活性。本研究利用分子對接和SPRi 技術，挖掘分析人參皂苷調節MAPK 信號通路的關鍵成分和作用靶點。共篩選得到（20R）-ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、ginsenoside Rg1、pseudoginsenoside F11、panaxadiol、ginsenoside Rb2、pseudoginsenoside Rh2 等7 種成分，調節關鍵靶點ERK1。研究發現，人參能夠緩解非小細胞肺癌患者的嘔吐、腹瀉等癥狀，提高白細胞、血小板數量等，增強化療的效果、減少不良反應、提高免疫力等［17］。人參根總提取物能夠在體內和體外抑制MAPK 信號通路激活自噬、減輕炎癥［18］。Ginsenoside Rg1 能夠抑制6-OHDA 誘導的ERK1／2 磷酸化［19］；ginsenoside Rb2 通過作用于Ras-ERK1／2 信號通路來保護骨髓間充質干細胞免受地塞米松誘導的細胞凋亡［20］。結合本實驗結果，推測（20R）-ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、ginsenoside Rg1 等可能是人參等藥材抗癌的重要活性成分之一，能夠作用于ERK 蛋白靶點。

綜上所述，本研究基于分子對接和SPRi 技術分析了人參皂苷與ERK 信號通路的相互作用，為人參皂苷機制研究及ERK1 蛋白抑制劑研究提供方向，也為中藥體外篩選提供新思路。同時，體外和體內存在一定差異，需要分子實驗、細胞實驗和動物實驗等進行分析驗證。