小柴胡湯含藥血清體外抗流感病毒的實驗研究

霍雨佳，陳佳亮，鄒文瑋，郝莉鵬，2，張 磊，楊沛霖，李凌威，周一心，2*，潘麗峰，2*

（1.上海市浦東新區疾病預防控制中心，上海 200136；2.復旦大學浦東預防醫學研究院，上海 200136；3.上海中醫藥大學上海中醫健康服務協同創新中心，上海 201203；4.上海市奉賢區四團鎮社區衛生服務中心，上海 201412）

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病［1-2］，全球每年大約有10 億人感染，其中重癥病例有300～500 萬例，死亡29～65 萬例［3］。A （H1N1） pdm09 和H3N2，Victoria 型（BV） 和Yamagata 型（BY） 是目前主要流行的流感病毒亞型［4-6］。由于奧司他韋等化學藥物大量使用，其耐藥性日益嚴重［7-9］，因此需研究其他藥物對流感的有效性與安全性。經方是“醫藥之祖”，小柴胡湯出自張仲景的《傷寒論》［10-11］，其中的柴胡、甘草等成分已被證實對感冒發燒、咳嗽痰多等癥狀有效并用于臨床治療［12］，但小柴胡湯方劑對流感的抗病毒作用研究鮮有報道。本研究通過探索小柴胡湯含藥血清對流感病毒A（H1N1） pdm09、H3N2、BV、BY 4 種亞型株的抑制作用，以期為該藥的臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 細胞 狗腎細胞 （Madin-Darby canine kidney cells，MDCK） 由上海市疾病預防控制中心提供。

1.2 毒株 流感病毒A （H1N1） pdm09、H3N2、BV、BY 亞型株為本實驗室保存，其序列與A／Hawaii／70／2019（H1N1） 、A／Kansas／14／2017 （H3N2）、B／Victoria／17／2022、B／Washington／28／2020 無明顯差異。

1.3 動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級SD 大鼠，體質量（300±15） g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （京）2016-0006］，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心的SPF級屏障內，實驗過程經上海中醫藥大學倫理委員會批準（倫理號PZSHUTCM220822005）。

1.4 藥物與試劑 小柴胡湯含藥血清由上海中醫藥大學協同創新中心制備。磷酸奧司他韋膠囊（上海羅氏制藥有限公司，批號SH0093），無菌稀釋至7 500 μg／mL 備用。DMEM 培養基、胎牛血清、EDTA-胰酶、青霉素-鏈霉素、HEPES 緩沖液、HBSS （美國Gibco 公司，批號2428750、2547014P、2323487、2199830、2428706、2492851）；TPCK-胰酶（美國Sigma 公司，CAS 號9002-07-7）；MTT 細胞增殖檢測試劑盒［生工生物工程（上海） 股份有限公司，批號IA19FA0007］。

1.5 儀器 生物安全柜（型號BSC-1500ⅡA2-X，山東博科醫療器械有限公司）；倒置顯微鏡（型號CKX41，日本Olympus 公司）；全自動酶聯免疫檢測儀（型號ELX800，美國BioTek 公司）；CO2培養箱（型號CCL-240B-8，新加坡ESCO 公司）；細胞計數儀（型號IC1000，上海睿鈺生物科技有限公司）；低溫冰箱（型號HYC-360，海爾集團公司）；水浴恒溫振蕩器（型號HSHZ-B，上海躍進醫療器械有限公司）；十功能自動煎藥機、液體濃縮機（型號NS01、NS01，北京東華原醫療設備有限責任公司）。

2 方法

2.1 細胞生長液和病毒生長液的配制 500 mL DMEM 中加入青霉素-鏈霉素5 mL （終濃度為青霉素100 U／mL 和鏈霉素100 μg／mL） 和12.5 mL HEPES 緩沖液（終濃度為25 mmol／L）。將50 mL 胎牛血清加到450 mL 上述混合DMEM 中，使胎牛血清終濃度為10%，即得細胞生長液；向上述混合DMEM 中每500 mL 加入0.5 mL TPCK-胰酶（母液濃度為2 mg／mL，終濃度為2 μg／mL），即得病毒生長液。

2.2 小柴胡湯的制備 按照《傷寒論》 中小柴胡湯的原方比例，柴胡半斤（24 g）、黃芩三兩（9 g）、人參三兩（9 g）、甘草三兩（9 g）、姜半夏半升（9 g）、生姜三兩（9 g）、大棗四枚（9 g） （藥材經上海中醫藥大學吳靳榮教授鑒定為正品） 配制。第1 次加8 倍量水煎煮，其中煎煮前先加入7 倍量水浸泡30 min，選擇常壓煎煮模式，武火煮沸后轉為文火煎煮30 min；第2 次煎煮時，機器自動補充進20%加水量，武火煮沸后轉為文火煎煮20 min，合并2 次煎煮的藥液，投入液體濃縮機，濃縮至所需濃度備用。

2.3 小柴胡湯含藥血清的制備 10 只大鼠隨機分為中藥組和對照組。小柴胡湯灌胃劑量依據人與大鼠體表面積換算得到為7.02 g／kg，對照組給予生理鹽水，每天早晚各灌胃1 次，連續5 d。末次給藥后1 h，大鼠腹腔注射水合氯醛（350 mg／kg） 麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置0.5 h。4 ℃、3 000 r／min 離心10 min，取血清，同組大鼠血清合并混勻，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm 微孔濾膜無菌過濾，收集濾液，無菌封裝，于-80 ℃冰箱保存備用。小柴胡湯含藥血清經測定原始質量濃度為6 521.58 μg／mL。

2.4 MTT 法檢測細胞活力 按照試劑盒使用說明書，在待測細胞孔中每孔加入10 μL MTT 試劑（終質量濃度為0.5 mg／mL），輕輕混合后在34 ℃、5% CO2培養箱中孵育4 h，吸棄培養基，每孔加入100 μL Formazan 增溶溶液，將孔板置于搖床上輕輕搖晃10 min 以溶解甲臜結晶，使用酶標儀測定490 nm 波長處的吸光度值。

2.5 CPE 法觀察細胞生長狀態 將藥物或病毒接種于生長狀態良好的單層MDCK，于36 ℃、5% CO2培養箱中培養，每天觀察細胞生長狀態，以藥物或病毒的最高稀釋度不再出現新病變為終點，記錄病變情況與孔數（CPE＞50%為病變，CPE＜50%為非病變），見圖1。

圖1 MDCK 不同形態觀察（×200）

2.6 半數中毒濃度（TC50） 測定 將生長狀態良好、長成單層的MDCK 用EDTA-胰酶消化成單個細胞，用細胞生長液調整細胞密度為8×105／mL，接種至96 孔細胞培養板中，每孔100 μL，于36 ℃、5% CO2培養箱中培養20 h，形成單層細胞備用。小柴胡湯含藥血清從6 521.58 μg／mL 倍比稀釋至50.95 μg／mL 共8 個質量濃度，每個稀釋度均重復4孔，于34 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。按照“2.4” 項下MTT 法測定各孔吸光度值，并計算TC50及細胞存活率。

2.7 半數有效濃度（EC50） 測定 將流感病毒A （H1N1）pdm09、H3N2、BV、BY 4 種亞型株連續10 倍遞次稀釋成1×10-1～1×10-6后，將各稀釋度病毒接種于MDCK 中，每個稀釋度設4 個復孔，于34 ℃、5% CO2培養箱中培養，設置正常細胞對照，48 h 后觀察病變孔數，用Reed-Muench法計算流感病毒4 種亞型株的半數組織培養感染劑量（median tissue culture infective dose，TCID50）。在小柴胡湯含藥血清對MDCK 的TC50范圍內，加入50 μL 配制好的100 TCID50流感病毒4 種亞型病毒液，再加入不同質量濃度小柴胡湯含藥維持液，每孔50 μL，于34 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，每一藥物濃度均重復4 孔，設置正常細胞對照、病毒對照、空白血清對照、陽性藥物對照。按照“2.4” 項下MTT 法測定各孔吸光度值，并計算EC50、病毒抑制率及治療指數（therapeutic index，TI），公式為TI＝TC50／EC50。

2.8 統計學分析 通過SPSS 22.0 及Excel 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，細胞存活率與藥物濃度之間的關系用Probit 回歸進行分析，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小柴胡湯含藥血清對MDCK 的TC50小柴胡湯含藥血清質量濃度從6 521.58 μg／mL 稀釋至50.95 μg／mL 等8 個質量濃度時，細胞存活率從15.95% 升高至95.27%，細胞存活率和藥物質量濃度呈反比。未用小柴胡湯含藥血清處理的正常細胞存活率為100%。用Probit 回歸法統計分析，小柴胡湯含藥血清對MDCK 的TC50為3 533.59 μg／mL，磷酸奧司他韋的TC50為1 226.62 μg／mL，見圖2。

圖2 小柴胡湯含藥血清和磷酸奧司他韋對MDCK 的細胞毒性作用

3.2 小柴胡湯含藥血清的EC50用Reed-Muench 法計算得流感病毒A （H1N1） pdm09、H3N2、BV、BY 4 種亞型株的TCID50分別為1×10-3.1、1×10-2.8、1×10-2.8、1×10-3.0。在小柴胡湯含藥血清對MDCK 的TC50范圍內，病毒抑制率與小柴胡湯含藥血清質量濃度呈正相關 ［rA（H1N1）pdm09＝0.719，P＜0.001；rH3N2＝0.709，P＝0.001；rBV＝0.703，P＝0.001；rBY＝0.878，P＜0.001］。在小柴胡湯含藥血清質量濃度為1 630.40 μg／mL 時，對流感病毒4 種亞型株的抑制率分別為79.46%、88.16%、54.28%、57.38%；當質量濃度低至50.95 μg／mL 時，抑制率分別為 22.22%、33.20%、12.83%、11.15%。小柴胡湯含藥血清對流感病毒4 種亞型株的EC50分別為288.12、173.90、1 037.85、1 107.27 μg／mL，TI 分別為12.26、20.32、3.40、3.19。磷酸奧司他韋膠囊的EC50分別為316.54、155.77、111.28、197.74 μg／mL，TI 分別為3.88、7.87、11.02、6.20，見表1～3。

表1 小柴胡湯含藥血清對流感病毒4 種亞型株的抑制作用（±s，n＝4）

表1 小柴胡湯含藥血清對流感病毒4 種亞型株的抑制作用（±s，n＝4）

注：與50.95 μg／mL 小柴胡湯含藥血清組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

小柴胡湯含藥血清／（μg·mL-1）抑制率／%A（H1N1）pdm09H3N2BV BY 1 630.4079.46±0.15▲▲88.16±0.24▲▲54.28±0.12▲▲57.38±0.05▲▲815.2063.64±0.14▲▲75.10±0.18▲47.77±0.02▲▲44.26±0.06▲▲407.6056.23±0.16▲62.55±0.1239.03±0.17▲36.07±0.03▲▲203.8045.29±0.1350.77±0.1131.60±0.0826.89±0.09▲101.9033.22±0.0439.38±0.1223.54±0.0718.03±0.05 50.9522.22±0.1633.20±0.1812.83±0.1211.15±0.05

表2 磷酸奧司他韋對流感病毒4 種亞型株的抑制作用（±s，n＝4）

表2 磷酸奧司他韋對流感病毒4 種亞型株的抑制作用（±s，n＝4）

磷酸奧司他韋／（μg·mL-1）抑制率／%A（H1N1）pdm09H3N2BVBY 937.502.29±0.0016.40±0.0816.56±0.237.08±0.00 468.7545.14±0.0052.71±0.0174.49±0.3158.86±0.00 234.3852.57±0.0554.65±0.0266.23±0.0454.77±0.00 117.1945.43±0.0548.53±0.0651.72±0.2239.78±0.00 58.5941.14±0.0042.05±0.0540.77±0.1135.29±0.01

表3 小柴胡湯含藥血清和磷酸奧司他韋對流感病毒4 種亞型株的抑制作用

4 討論

我國中藥自然資源豐富，在防治病毒性疾病尤其是流感方面已取得較大成就［13-15］。顏海燕等［16］研究發現熱毒寧注射液對流感病毒多個亞型有抑制作用；徐國雙等［17］研究表明小槐花提取物能有效阻抑流感病毒；趙利華等［18］研究發現清開靈注射液在體外有拮抗流感病毒H1N1、H5N1、H7N9 3 種亞型的作用。

小柴胡湯由柴胡、黃芩、半夏、人參、生姜、甘草、大棗7 味藥材組成，是和解少陽的代表方劑［19-20］。黃芩、甘草等單味中藥和連花清瘟膠囊、雙黃連制劑等復方藥物已應用于臨床［21］。為了確定小柴胡湯含藥血清的抗流感病毒作用，本研究使用流感病毒敏感細胞MDCK 進行體外細胞實驗，觀察小柴胡湯含藥血清對流感病毒A （H1N1）pdm09、H3N2、BV、BY 4 種亞型株的抗病毒作用。研究發現小柴胡湯含藥血清對4 種流感病毒亞型株均有抗病毒作用，表現為病毒抑制率隨著藥物質量濃度的增加而增加，呈正相關作用，但對4 種流感病毒亞型株的病毒抑制率不同，其中對甲型流感病毒株的病毒抑制率高于乙型流感病毒株，原因可能是小柴胡湯含藥血清對2 種類型病毒的敏感性不同。小柴胡湯含藥血清對MDCK 的TC50為3 533.59 μg／mL，磷酸奧司他韋的TC50為1 226.62 μg／mL，提示小柴胡湯含藥血清的毒性小于磷酸奧司他韋。小柴胡湯含藥血清對4 種流感病毒亞型株的EC50分別為288.12、173.90、1 037.85、1 107.27 μg／mL，表明小柴胡湯含藥血清對甲型流感病毒株的抑制效果優于乙型流感病毒株。小柴胡湯含藥血清對4 種流感病毒亞型株的TI 分別為12.26、20.32、3.40、3.19，而磷酸奧司他韋的TI 分別為3.88、7.87、11.02、6.20，結果表明小柴胡湯含藥血清對甲型流感病毒的治療指數和安全性均高于磷酸奧司他韋。

綜上所述，小柴胡湯含藥血清在體外能有效抑制流感病毒，具有抗流感病毒作用，但其有效成分與抗病毒作用的關系有待進一步研究。