烏蘭-13 味湯煎煮工藝優(yōu)化

彩 霞，包啊若汗，吳小花，韓平安，布仁巴圖

[1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床醫(yī)（蒙醫(yī)） 學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000]

烏蘭-13 味湯是蒙醫(yī)臨床常用蒙藥復(fù)方制劑之一，載自《觀者之喜》 第五章收錄之“烏蘭-13”，《蒙藥驗方》 《中國醫(yī)學(xué)百科全書·蒙醫(yī)學(xué)》均有記載［1］，由三子湯（訶子、川楝子、梔子）、查干湯（土木香、苦參、山奈、懸鉤子木）、四紅湯（枇杷葉、紫草、紫草茸、茜草）、橡子、金蓮花等13 種單味藥材組成，具有清血熱功效。湯劑作為蒙成藥十大傳統(tǒng)劑型之一，具有起效快、容易吸收的特點，但目前有關(guān)其煎煮工藝方面的研究尚少，故本實驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化烏蘭-13 味湯煎煮工藝，以期為該方煎煮規(guī)范提供實驗依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；EX-H516A 型電子天平（百萬分之一） （天津市德安特傳感技術(shù)有限公司）；XJ220ASCS 型電子天平（上海市天美天平儀器有限公司）；KH-500DE 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；SYG-A2-8 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；RS-60 型高純水機（山東新瑞分析儀器有限公司）；N-1300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；AP-01P 型真空泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；電熱套（上海勒頓實業(yè)有限公司）；液相玻璃砂芯過濾裝置；1 000 mL 圓底燒瓶；冷凝管；量瓶；量筒；0.22 μm 濾頭；0.45 μm 微孔濾膜。

蒙藥烏蘭-13 味湯由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供（批號20201264）。訶子（批號20210120）、紫草茸（批號20201128） 均購于安徽中美堂中藥飲片有限公司；梔子（批號20210123）、橡子 （批號2020110）、苦參 （批號20201004）、川楝子 （批號 20200803）、茜草 （批號20200914）、枇杷葉 （批號 20201135）、紫草 （批號20201112）、山柰（批號20191201） 均購于安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司；土木香（批號20201134） 購于河北國松堂制藥有限公司；懸鉤子木（批號20170766）、金蓮花（批號20160632） 均購于安國市彤康藥業(yè)有限公司，經(jīng)專家鑒定為正品。沒食子酸 （批號110831-201906，純度91.5%）、鞣花酸（批號111959-201903，純度88.8%）、梔子苷（批號ST0333WL0120，純度97.1%）、京尼平龍膽雙糖苷 （ST56070120，純度≥98%）、葒草苷 （批號D0009173，純度98.1%）、西紅花苷I （ST02900120，純度≥98%） 對照品均購于中科華檢 （北京） 科技有限公司。

甲醇為色譜純（德國默克公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 各成分含量測定 采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 Eclipse XDB-C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1% 磷酸，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長1～10 min 271 nm （沒食子酸），10～40 min 235 nm （京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷），40～58 min 350 nm （葒草苷），58～74 min 255 nm （鞣花酸），74～85 min 440 nm （西紅花苷I）；進樣量3 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 干粉制備 取原方藥材粉末約15 g，加600 mL 純水浸泡30 min，加熱回流提取3 次，每次90 min，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至大約100 mL 后水浴鍋、烘干箱聯(lián)合低溫烘干，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取“2.1.2” 項下干粉1 g，置于25 mL 棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，密塞，超聲處理30 min，甲醇定容至刻度，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，置于棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲處理3～5 s，搖勻，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為沒食子酸0.055 mg／mL、京尼平龍膽雙糖苷0.35 mg／mL、梔子苷1.165 mg／mL、葒草苷0.085 mg／mL、鞣花酸 0.045 mg／mL、西紅花苷Ⅰ0.035 mg／mL）。

2.1.5 線性關(guān)系考察 取“2.1.4” 項下對照品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下分別進樣1、2、3、4、5 μL 測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.4” 項下對照品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得沒食子酸、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、葒草苷、鞣花酸、西紅花苷I峰面積RSD 分別為1.15%、1.14%、1.13%、1.04%、1.00%、0.75%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取 “2.1.2” 項下干粉1 g，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、葒草苷、鞣花酸、西紅花苷I 峰面積RSD 分別為0.72%、0.68%、0.75%、0.79%、1.90%、0.84%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗 取 “2.1.2” 項下干粉1 g，按“2.1.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、葒草苷、鞣花酸、西紅花苷I 峰面積RSD 分別為0.74%、0.88%、0.79%、1.04%、1.89%、0.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率實驗 取各成分含量已知的“2.1.2”項下干粉約0.5 g，共6 份，精密加入各對照品適量，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，沒食子酸、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、葒草苷、鞣花酸、西紅花苷I 平均加樣回收率分別為 93.38%、100.80%、99.62%、101.24%、102.94%、88.22%，RSD 分別為 0.68%、1.5%、1.21%、1.33%、1.1%、1.22%。

2.2 出膏率、綜合評分計算

2.2.1 出膏率 參考2020 年版《中國藥典》［4］中的水溶性浸出物熱浸法，精密量取原方煎煮湯25 mL，置于恒重蒸發(fā)皿中，100 ℃水浴蒸干，放入105 ℃烘干箱中3 h，轉(zhuǎn)移至干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質(zhì)量，計算出膏率［5］，公式為出膏率＝［（蒸發(fā)皿和浸膏總質(zhì)量-蒸發(fā)皿質(zhì)量） ×煎煮液總體積／煎煮液量取量×全方質(zhì)量］ ×100%。

2.2.2 綜合評分 參考文獻［2-3］ 報道，設(shè)置總分為100分，其中各指標(biāo)權(quán)重分別為梔子苷含量25 分，京尼平龍膽雙糖苷含量20 分，西紅花苷I 含量10 分，葒草苷含量10分，沒食子酸含量5 分，鞣花酸含量5 分，出膏率25 分，計算綜合評分，公式為綜合評分＝梔子苷含量／最大梔子苷含量×25+出膏率／最大出膏率×25+京尼平龍膽雙糖苷含量／最大京尼平龍膽雙糖苷含量×20+葒草苷含量／最大葒草苷含量×10+西紅花苷I 含量／最大西紅花苷I 含量×10+沒食子酸含量／最大沒食子酸含量×5+鞣花酸含量／最大鞣花酸含量×5。

2.3 煎煮工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗

2.3.1.1 浸泡時間 取原方藥材粉末約15 g，共5 份，加入40 倍量水分別浸泡20、30、40、50、60 min 后煎煮60 min，濾過，按 “2.1.2” 項下方法制備干粉，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，按“2.2.2” 項下方法計算綜合評分。結(jié)果，浸泡30 min 時綜合評分最高，并且進一步延長時呈緩慢降低趨勢，最終選擇20、30、40 min 進行后續(xù)考察。

2.3.1.2 加水量 取原方藥材粉末約15 g，分別加入20、30、40、50、60 倍量水浸泡30 min 后煎煮60 min，濾過，按“2.1.2” 項下方法制備干粉，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，按“2.2.2” 項下方法計算綜合評分。結(jié)果，加40 倍量水時綜合評分較高，并且進一步增加時仍呈緩慢升高趨勢，考慮到服用劑量、順應(yīng)性等臨床實際情況，最終選擇40、50、60 倍進行后續(xù)考察。

2.3.1.3 煎煮時間 取原方藥材粉末約15 g，共5 份，加入60 倍量水浸泡30 min 后分別煎煮30、45、60、75、90 min，濾過，按“2.1.2” 項下方法制備干粉，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，按“2.2.2” 項下方法計算綜合評分。結(jié)果，煎煮60 min 時綜合評分最高，最終選擇45、60、75 min 進行后續(xù)考察。

2.3.2 響應(yīng)面法 結(jié)合原方傳統(tǒng)用法、患者順應(yīng)性、后期開發(fā)研究，最終確定煎煮次數(shù)為1 次并不再進行優(yōu)化。在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇浸泡時間（A）、加水量（B）、煎煮時間（C） 作為影響因素，綜合評分（Y） 作為評價指標(biāo)，因素水平見表3，結(jié)果見表4。

表3 因素水平

表4 試驗設(shè)計與結(jié)果

采用Design Expert 10.0 軟件對表4 數(shù)據(jù)進行多元線性回歸，得方程為Y＝96.97-0.47A+0.27B-1.80C+0.18AB-2.5× 10-3AC-0.15BC-1.70A2-2.73B2-0.80C2（R2＝0.976 2，AdjR2＝0.945 7，PreR2＝0.925 5），表明模型擬合度良好，可用于分析預(yù)測，方差分析見表5。由此可知，模型P＜0.000 1，具有高度顯著性；失擬項P＞0.05，表明無失擬因素存在；因素C、A2、B2有極顯著影響 （P＜0.01），B、C2有顯著影響（P＜0.05）；各因素影響程度依次為煎煮時間（C） ＞加水量（B） ＞浸泡時間（A）。

表5 方差分析

響應(yīng)面分析見圖2。最終確定，最優(yōu)工藝為加水量51.12 倍，浸泡時間29.504 min，煎煮時間45 min，結(jié)合臨床應(yīng)用情況、操作可行性，將其修正為加水量51 倍，浸泡時間30 min，煎煮時間45 min。

圖2 各因素響應(yīng)面圖

2.3.3 驗證試驗 按“2.3.2” 項下方法進行3 批驗證試驗，測得綜合評分分別為98.97、97.66、98.35 分，平均值為98.33 分，RSD 為0.67%，與預(yù)測值98.015 分接近，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 檢測波長選擇 本實驗采用紫外分光光度計，對各成分進行200～600 nm 全波長掃描，再參照2020 年版《中國藥典》 結(jié)合相關(guān)文獻，最終確定最大吸收波長分別為沒食子酸271 nm，梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷235 nm，鞣花酸255 nm，葒草苷350 nm，西紅花苷Ⅰ440 nm。

3.2 指標(biāo)成分選擇及其權(quán)重分配 烏蘭-13 味湯中各單味藥占比依次為懸鉤子木＞梔子、橡子、紫草茸＞金蓮花、訶子、土木香、枇杷葉、苦參、川楝子、茜草＞山奈、紫草，主治血熱上盛、頭痛、高血壓、目赤等［6］。其中，梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ均為梔子有效成分，并且該藥材在方中的比例較高，為主要清血熱成員，同時大量研究表明上述成分具有降壓、降脂、抗血栓、神經(jīng)保護、抗血小板聚集、改善心肌缺血再灌注損傷、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗動脈粥樣硬化等藥理活性，與高血壓、高血脂等心血管疾病密切相關(guān)［7-12］，但三者含量在煎煮液中差異較大，最終分別賦予25、20、10 分。另外，葒草苷是金蓮花有效成分，具有心肌保護、改善脊髓損傷后運動功能、神經(jīng)保護等作用［13-16］，可能是烏蘭-13 味湯治療薩病（腦卒中） 的重要成分，但其含量偏低，因此賦予10 分；沒食子酸、鞣花酸均可作為訶子質(zhì)量控制的指標(biāo)成分［17］，具有降壓、降糖、抗炎、抗氧化、抗動脈硬化及保護心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等作用［18-22］，故各賦予5 分；復(fù)方制劑出膏率對劑型選擇、制備工藝、用藥方案等方面均有重要意義，故賦予25 分［23］。