低共熔溶劑對黃連中生物堿綠色提取工藝的優化

仝洺慧，朱 越，李佳凝，王 慧，何 妍，王一男

（徐州醫科大學新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004）

黃連為毛莨科植物黃連CoptischinensisFranch.的根莖，具有保護心腦血管、降血糖、抗炎、抗腫瘤等作用，其主要藥用成分為生物堿類［1-3］。2020 年版《中國藥典》 規定，黃連堿、黃連素、巴馬汀等為黃連指標性成分［4］。傳統萃取黃連中生物堿的方法有超聲波法、回流法、冷浸法、輔助酶法等［5-7］。存在萃取效率不高、萃取時程過長且環境不友好等缺點，因此探尋一種綠色、高效的黃連生物堿萃取技術成為當務之急。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；AB265-S 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；VS-Tenoe 掃描電子顯微鏡（美國FEI 公司）；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；BT25S 電子分析天平［賽多利斯（北京） 生物科技有限公司］；TGL-16C離心機（上海安亭儀器有限公司）；B-220 數顯恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500E 超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9240A 電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 黃連購自徐州市康源大藥房，批號190903，經徐州醫科大學張春平副教授鑒定為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖。鹽酸巴馬汀（貨號S0422AS，純度≥99.9%）、黃連素（貨號F0126AS，純度≥99.9%）、藥根堿（貨號S0913AS，純度≥99.9%） 對照品，氯化膽堿、甜菜堿、脯氨酸、葡萄糖、果糖、檸檬酸、蘋果酸、甘油、乳酸、木糖醇、尿素為分析純（大連美侖生物技術有限公司）。甲醇（美國Fisher 公司）；冰醋酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為純化水。

2 方法

2.1 低共熔溶劑制備 取氯化膽堿、甜菜堿、葡萄糖、果糖、檸檬酸、蘋果酸、甘油、乳酸、木糖醇、尿素適量，按照一定比例置于燒杯中，并加入固定比例的水以降低黏度，在80 ℃水浴下加熱并攪拌，直至燒杯中形成均一的液體，冷卻轉移，避光保存。初次共合成10 組低共熔溶劑，見表1，氫鍵受體-氫鍵供體比例1 ∶2，含水量20%。

表1 低共熔溶劑類型

2.2 低共熔溶劑對黃連生物堿成分的提取 取黃連適量干燥30 min，用球磨粉碎機粉碎15 min，粉末過80 目篩，精密稱取黃連粉末250 mg，置于15 mL EP 管中，加入一定體積配置好的低共熔溶劑10 mL，混合均勻后，超聲提取30 min，待EP 管中溶液冷卻至室溫，將溶液轉移至離心管內，13 000 r／min 離心10 min，取上清液，即為黃連粗提取液。同法采用甲醇、水對黃連中的生物堿成分進行提取。

2.3 低共熔溶劑的紅外光譜掃描 低共熔溶劑單體和合成后的溶劑通過KBr 壓片法或KBr 薄片直接測定法進行紅外光譜掃描，波長掃描范圍4 700～340 cm-1；掃描次數20；變跡函數Happ-Genze。

2.4 黃連粉末提取前后掃描電子顯微鏡檢測 取不同溶劑提取后的黃連粉末，分散后載于測試銅板上，采用掃描電子顯微鏡（SEM） 觀察黃連粉末經過提取前后的顯微結構變化。

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件 Universil XB C18色譜柱 （150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相2 mmol／L 三乙胺（pH＝9.0）（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～30 min，25%～70%B）；體積流量0.5 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長270 nm；進樣量2 μL。

在描述和學校的關系時，59.03%的大學生持積極情感態度，以強調學校給其帶來的輕松、愉悅的情感體驗為價值取向；而40.97%的大學生則持消極情感態度，以強調學校給其帶來的禁錮、痛苦的情感體驗為價值取向，所占比例較大。

2.5.2 對照品溶液制備 精密稱取藥根堿、巴馬汀、黃連素對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度為1.0 mg／mL 的貯備液，精密量取適量，置于同一10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含藥根堿（2、5、10、50、80、100 μg／mL）、巴馬汀（4、10、20、100、160、200 μg／mL）、黃連素 （20、50、100、500、800、1 000 μg／mL） 的溶液，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.5.3 供試品溶液制備 取“2.2” 項下粗提取液適量，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，加水稀釋5 倍，即得。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性考察 取對照品、供試品溶液適量，在“2.5.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，藥根堿、巴馬汀、黃連素與其他成分均達到基線分離，并且分離度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.6.2 線性關系考察 取“2.5.2” 項下對照品溶液適量，在“2.5.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，以S／N＝3時的質量濃度為檢出限，S／N＝10 時的質量濃度為定量限，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.6.3 精密度試驗 取“2.5.2” 項下對照品溶液適量，質量濃度分別為藥根堿50 μg／mL、巴馬汀80 μg／mL、黃連素400 μg／mL，在“2.5.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得藥根堿、巴馬汀、黃連素峰面積RSD 分別為1.52%、1.42%，1.18%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復性試驗 取黃連粉末的甜菜堿-乳酸（1 ∶3）提取液，平行6 份，在“2.5.1” 項色譜條件下進樣測定，測得藥根堿、巴馬汀、黃連素含量RSD 分別為2.18%、2.51%、2.01%，表明該方法重復性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗 精密量取各成分含量已知的甜菜堿-乳酸（1 ∶3） 低共熔溶劑9 份，加入“2.5.2” 項下對照品溶液適量，按“2.5.3” 項下方法制備低、中、高水平（80%、100%、120%） 供試品溶液各3 份，在“2.5.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，藥根堿回收率為97.7%～102.7%，RSD ≤2.2%；巴馬汀回收率為97.9%～98.8%，RSD≤2.3%；黃連素回收率為98.2%～100.1%，RSD≤2.1%。

3 結果

3.1 低共熔溶劑選擇 以藥根堿、巴馬汀、黃連素總含量為計算指標，比較不同低共熔溶劑與傳統溶劑提取效率的差異，結果見圖2。由此可知，甜菜堿-乳酸（1 ∶2） 提取總生物堿含量的效率最高，且高于傳統的甲醇、水提取的方法，所以選取甜菜堿-甘油為提取黃連總生物堿的低共熔溶劑。

圖2 黃連中總生物堿成分經過不同溶劑提取后的總含量

3.2 單因素試驗

3.2.1 低共熔溶劑比例 篩選出提取率最高的低共熔溶劑甜菜堿-乳酸后，合成不同比例的低共熔溶劑（1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4）。隨著甘油比例升高，提取生物堿的量升高，在1 ∶4 時下降，結果見圖3A。因此，選擇甜菜堿與乳酸比例1 ∶3 作為最佳水平。

圖3 單因素試驗結果

3.2.2 低共熔溶劑含水量 含水量具有調節低共熔溶劑黏度、極性作用［11-12］。固定提取時間30 min，料液比15 ∶1，考察不同比例水（0、10%、20%、30%、40%） 對黃連生物堿提取率的影響，結果見圖3B。隨著水比例增加生物堿含量升高，在30%時最高，再增加時反而下降。因此，選擇30%作為水比例最佳水平。

3.2.3 料液比 低共熔溶劑的體積大小決定了藥材粉末是否能充分浸潤、目標化合物能否有效溶出［13］。固定水比例20%，提取時間30 min，考察不同料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30） 對黃連生物堿提取率的影響，結果見圖3C。隨著料液比增加，藥材充分浸潤，生物堿提取率不斷升高，在1 ∶20 時達到最大值，再增加時變化不大。因此，選擇1 ∶20 作為料液比最佳水平。

3.2.4 提取時間 在一定時間段內，活性成分溶出率隨著時間的增加而增加，然而達到一定時間后，溶液體系滲透壓達到平衡時溶出率變化不大［14-15］。固定提取水比例30%，料液比20 ∶ 1，考察不同提取時間 （10、20、30、40、50 min） 對提取率的影響，結果見圖3D。在30 min 內，生物堿提取率隨著提取時間延長而增加，繼續延長時無明顯變化。從節省時間和能源角度考慮，選擇30 min 作為提取時間最佳水平。

綜上所述，同等條件下實驗中合成的低共熔溶劑對黃連中生物堿類化合物的提取優于傳統的水提取法、醇提取法。經過提取試驗優化，黃連總生物堿優化后的最終提取工藝為甜菜堿與乳酸比例1 ∶3，低共熔溶劑含水量30%，料液比1 ∶20，提取時間30 min。

3.3 低共熔溶劑的紅外光譜掃描 對甜菜堿通過KBr 壓片法進行紅外光譜掃描，乳酸與合成的甜菜堿-乳酸低共熔溶劑采用KBr 薄片直接測定法進行紅外光譜掃描，結果見圖4。

圖4 低共熔溶劑成分紅外光譜圖

由此可知，在低共熔溶劑紅外譜中均可觀察到甜菜堿和乳酸的特征吸收峰。乳酸可觀察到較寬的O-H 伸縮振動吸收峰。甜菜堿-乳酸（1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4） 的O-H 伸縮振動分別為3 389、3 381、3 377 cm-1，羥基基團的紅外特征波長發生位移表明合成的甜菜堿-乳酸低共熔溶劑中氫鍵的形成。甜菜堿-乳酸（1 ∶3） 的羥基吸收峰比其他組的吸收峰更寬、強度更強，表明甜菜堿-乳酸（1 ∶3） 中氫鍵形成的數量最多。

3.4 黃連提取前后SEM 檢測 未經提取的黃連粉末可觀察到較為完整的黃連粉末顆粒結構（圖5A）。經過不同溶劑作為溶出介質的超聲提取后，黃連粉末顆粒遭到不同程度的破壞。黃連植物細胞和細胞壁破壞越嚴重，則黃連中有效成分釋放越多。經過甲醇提取后，黃連粉末顆粒表面可觀察到致密細孔（圖5B）；經過水提取后，黃連粉末顆粒表面可觀察到較為疏松的細孔（圖5C）；經過甜菜堿-乳酸（1 ∶3） 提取后，黃連粉末顆粒破壞較為嚴重，可觀察到較大空洞（圖5D）。

圖5 黃連粉末提取前后掃描電鏡圖

4 結論

低共熔溶劑作為一種新型類離子溶劑，它的熔點明顯低于各組分物質的熔點，大多數季銨鹽與氫鍵供體形成的低共熔溶劑的密度通常略大于水的密度，且低共熔溶劑的揮發性低，被萃取的物質相對而言難于揮發，熱穩定性好，具有超分子結構，紅外圖譜證實低共熔溶劑分子間存在較強的氫鍵并能與水發生強烈作用，對極性和弱極性物質溶解性強于普通溶劑。同時，低共熔溶劑與多數離子液體類似，具有低飽和蒸汽壓并且能夠調節物質的選擇性和極性，因此，在提取黃連中生物堿類化合物時，能提高溶解度，在超聲輔助下能增強植物細胞壁的破壞力，比水提取法和醇提取法的效率更高。且低共熔溶劑的黏度隨著溫度的降低而升高，合成時溫度下的黏度高于室溫下的黏度，甜菜堿與乳酸按1 ∶3 比例合成的低共熔溶劑在室溫下比其它的低共熔溶劑較低，液體流動性較好，因此在提取效率上比合成的其它低共熔溶劑的提取效率高。

本研究以用氯化膽堿、甜菜堿、脯氨酸為氫鍵受體，D-果糖、檸檬酸、L-蘋果酸、甘油、DL-乳酸、木糖醇、尿素為氫鍵供體合成的低共熔溶劑，對黃連中生物堿類化合物進行提取，同時與水提取法和醇提取法進行了對比。通過HPLC 法進行提取物的含量測定，紅外光譜對合成的低共熔溶劑的官能團進行表征，同時通過單因素考察比較低共熔溶劑兩組分摩爾比例、提取時的時間、低共熔溶劑含水的比例、料液比對黃連生物堿提取效率的影響。黃連總生物堿優化后的最終提取工藝為甜菜堿與乳酸比例1 ∶3，低共熔溶劑含水量30%，料液比1 ∶20，提取時間30 min。

實驗結果表明，合成的低共熔溶劑對黃連中生物堿類化合物的提取優于傳統的水提取法和醇提取法。且合成的低共熔溶劑綠色，快速便捷，成本比傳統離子溶劑低，應用前景更為廣闊。因此，低共熔溶劑可用于對黃連中生物堿類化合物的提取。