六安瓜片茶多酚大孔吸附樹脂純化工藝及其降血糖活性研究

劉龍云，何曉梅，趙良冰，李欣冉，王 燕，張珍林，宋銳修

（1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230000；2.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；3.六安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，安徽 六安 237012）

茶葉Camelliasinensis（L.） O.Kuntze 是重要的經(jīng)濟(jì)作物，品類眾多，具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖、降血脂等作用［1-3］，主要成分為黃烷醇、花色苷、黃酮、黃酮醇、酚酸等［4］。研究表明，多酚類物質(zhì)是茶葉中的生物活性物質(zhì)，具有顯著抗氧自由基作用［5-6］，在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用［7］。隨著人們對茶多酚認(rèn)識的加深，其市場需求量越來越大，但它主要通過提取純化來獲得，故相關(guān)工藝亟需優(yōu)化改進(jìn)以滿足產(chǎn)業(yè)發(fā)展和社會需要。

目前，常用的提取純化方法均存在一些不足［8］，如微波輔助萃取操作可控性較低［9-10］；金屬離子沉淀法會造成重金屬殘留［11］；膜過濾法成本高，規(guī)模小［12］。本實驗利用大孔樹脂選擇性吸附的特點［13］來純化茶多酚，有著精準(zhǔn)、綠色、高效、安全的特點［14-15］，對制備高純度多酚具有重要意義［16］。

在六大茶類中，綠茶所含茶多酚含量最高［17-18］，六安瓜片作為中國十大名茶中之一的綠茶，是六安市大別山一帶非常重要的經(jīng)濟(jì)作物，故本實驗對其所含的茶多酚進(jìn)行大孔吸附樹脂純化，并探究其降血糖活性，以期為該品種開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 AE124 型電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；UV-5200 型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；JK-500B 型超聲波清洗器（合肥金尼克醫(yī)療科技有限公司）；SHZ-D （Ⅲ） 型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；PHS-25 型PH 計（上海志榮電子科技有限公司）；800A 型粉碎機(jī)（永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；40 目篩（華豐五金儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 血糖試紙（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）。AB-8、NKA-9、LSA-21 型大孔吸附樹脂（東鴻化工有限公司）。鏈脲佐菌素（STZ） （德國BioFroxx 公司）。綠茶茶多酚對照品（上海源葉生物科技有限公司）。酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、焦性沒食子酸（鄰苯三酚）、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸、檸檬酸鈉為分析純 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 藥材 六安瓜片購自安徽省六安瓜片茶業(yè)股份有限公司。

1.4 動物 昆明小鼠，SPF 級，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK （皖） 2017-001。

2 方法

2.1 提取液制備及茶多酚含量測定

2.1.1 制備方法 稱取六安瓜片2.0 g，粉碎后過40 目篩，置于燒杯中，加入50 mL 70% 乙醇，提取 （溫度70 ℃，功率600 W） 40 min，冷卻至室溫，3 500 r／min 離心10 min，殘渣用50 mL 70%乙醇再提取1 次，合并提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，加水稀釋，即得。

2.1.2 測定方法 采用福林酚比色法［19］測定。稱取沒食子酸對照品0.100 0 g，加水溶解后定容至100 mL，得1 000 μg／mL 母液，分別取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL 至100 mL 量瓶中，制成系列質(zhì)量濃度，分別取1 mL 至試管中，加入10% 福林酚試劑5.0 mL，避光反應(yīng)10 min，再加入7.5% Na2CO3溶液4.0 mL，充分混勻，50 ℃水浴10 min，冷卻至室溫，在765 nm 波長處測定吸光度。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得方程為A＝0.01X+0.041 7 （R2＝0.999 7），在10～90 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，再計算含量，公式為茶多酚含量＝其中V為提取液體積（100 mL），d為稀釋因子（1 mL 稀釋至100 mL，則其稀釋因子為100），SLOPESted為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，m為樣品質(zhì)量。

2.2 分離純化工藝研究

2.2.1 大孔吸附樹脂篩選 稱取等量AB-8、NKA-9、LSA-21 型樹脂，置于無水乙醇中浸泡24 h，去離子水洗滌至無醇味，置于5%鹽酸中浸泡24 h，去離子水洗至中性，置于5%NaOH 溶液中浸泡24 h，去離子水洗至中性，最后加入去離子水。分別稱取3.0 g （濕重） 至100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 提取液，保鮮膜密封，恒溫（25 ℃）、100 r／min 振蕩24 h，靜置后過濾，按“2.1.2” 項方法測定茶多酚含量，再計算吸附量、吸附率，公式分別為吸附量＝、吸附率＝×100%，其中m為樹脂質(zhì)量，C0為提取液中茶多酚含量，C1為吸附液中茶多酚含量，V1為吸附液體積。

將吸附飽和的3 種樹脂用一定體積去離子水沖洗，置于100 mL 錐形瓶中，加入80%乙醇20 mL，保鮮膜密封，恒溫（25 ℃）、100 r／min 振蕩24 h，靜置后抽濾，按“2.1.2” 項下方法測定茶多酚含量，計算解吸率，公式為解吸率＝×100%，其中C0為提取液中茶多酚含量，C1為吸附液中茶多酚含量，C2為解吸液中茶多酚含量，V1為吸附液體積，V2為解吸液體積。

2.2.2 靜態(tài)吸附工藝優(yōu)化

2.2.2.1 單因素試驗 （1） 吸附時間：取預(yù)處理好的AB-8 型樹脂3.0 g （濕重），轉(zhuǎn)移至100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 提取液（pH 值為6.0，含3.343 mg／mL 茶多酚），在25 ℃下吸附，每30 min 測定上清液中茶多酚含量，按“2.2.1” 項下方法計算吸附量。

（2） 吸附溫度：取預(yù)處理好的AB-8 型樹脂3.0 g （濕重），平行5 份，轉(zhuǎn)移至100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 提取液（pH 值為6.0，含2.866 mg／mL 茶多酚），分別在20、25、30、35、40 ℃下吸附2 h，測定上清液中茶多酚含量，按“2.2.1” 項下方法計算吸附量。

（3） 吸附pH 值：取預(yù)處理好的AB-8 型樹脂3.0 g（濕重），平行7 份，轉(zhuǎn)移至100 mL 錐形瓶中，加入20 mL提取液（含3.188 mg／mL 茶多酚），采用同體積酸堿試劑分別調(diào)節(jié)pH 值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在25 ℃下吸附2 h，測定上清液中茶多酚含量，按“2.2.1” 項下方法計算吸附量。

2.2.2.2 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以吸附時間（A）、吸附溫度（B）、吸附pH 值（C） 為影響因素，茶多酚吸附量為評價指標(biāo)，設(shè)計L9（33） 正交表，因素水平見表1。

表1 靜態(tài)吸附正交試驗因素水平

2.2.3 靜態(tài)解吸工藝優(yōu)化

2.2.3.1 單因素試驗 （1） 解吸時間：取吸附飽和的AB-8 型樹脂3.0 g，去離子水沖洗除去表面殘留液，抽濾后置于100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 80%乙醇，在25 ℃下解吸，每30 min 測定上清液中茶多酚含量至解吸結(jié)束，測定解吸平衡液吸光度，按“2.2.1” 項下方法計算解吸率。

（2） 乙醇體積分?jǐn)?shù)：取吸附飽和的AB-8 型樹脂3.0 g，去離子水沖洗除去表面殘留液，抽濾后置于100 mL 錐形瓶中，分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇各20 mL，在25 ℃下解吸2 h，測定解吸平衡液吸光度，按“2.2.1” 項下方法計算解吸率。

（3） 解吸溫度：取吸附飽和的AB-8 型樹脂3.0 g，去離子水沖洗除去表面殘留液，抽濾后置于100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 70% 乙醇，分別在20、25、30、35、40、45 ℃下解吸2 h，測定解吸平衡液吸光度，按“2.2.1” 項下方法計算解吸率。

2.2.3.2 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以解吸時間（A）、解吸溫度（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C） 為影響因素，茶多酚解吸率為評價指標(biāo)，設(shè)計L9（33） 正交表，因素水平見表2。

表2 靜態(tài)解吸正交試驗因素水平

2.3 茶多酚純度測定 將解吸后的樹脂進(jìn)行抽濾，收集濾液，適當(dāng)濃縮后冷凍干燥，再分別制備50 μg／mL 對照品、純化后樣品溶液，在紫外-可見光譜下測定吸光度，計算純度。

2.4 降血糖活性研究 60 只小鼠隨機(jī)分為6 組，每組10只，分別為空白組、模型組、對照組、茶多酚低劑量組、茶多酚中劑量組、茶多酚高劑量組［20］，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后禁食不禁水12 h，除空白組外各組小鼠以0.1 mL／10 g 劑量腹腔注射1%鏈脲佐菌素，而空白組小鼠腹腔注射等劑量檸檬酸緩沖液［21］，尾部取血，檢測血糖值，以大于11 mmol／L為造模成功。空白組、模型組小鼠灌胃給予蒸餾水，對照組小鼠灌胃給予600 mg／kg 綠茶茶多酚對照品溶液，茶多酚低、中、高劑量組小鼠分別灌胃給予“2.1” 項下300、600、1 200 mg／kg 提取液，劑量均為0.1 mL／10 g，連續(xù)30 d，每3 d 稱定1 次體質(zhì)量，最后1 次給藥后禁食，血糖監(jiān)測儀檢測血糖值，計算血糖下降率［22］，公式為血糖下降率＝小鼠脫臼處死，取心、肝、脾、腎、胸腺，稱定質(zhì)量，計算臟器指數(shù)［23］，公式為臟器指數(shù)＝

2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以（±s）表示。

3 結(jié)果

3.1 樹脂篩選 由表3 可知，各樹脂吸附能力依次為AB-8、LSA、NKA，解吸能力依次為AB-8、LSA、NKA-9，故選擇AB-8 型樹脂進(jìn)行后續(xù)研究。

表3 不同大孔吸附樹脂吸附、解吸能力比較

3.2 靜態(tài)吸附工藝優(yōu)化

3.2.1 單因素試驗 由圖1A 可知，茶多酚吸附量隨著吸附時間延長先升高，2 h 后趨緩，表明吸附2 h 時已接近飽和，故以其為最佳吸附時間。

圖1 靜態(tài)吸附工藝單因素試驗結(jié)果

由圖1B 可知，茶多酚吸附量隨著吸附溫度增加先升高，在25 ℃時達(dá)到最大值，但繼續(xù)增加時反而降低，這是因為當(dāng)溫度適當(dāng)升高時分子運動速度加快，有利于樹脂吸附；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時可能會使得茶多酚與空氣接觸加劇而發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致其含量降低，故以25 ℃為最佳吸附溫度。

由圖1C 可知，茶多酚吸附量隨著吸附pH 值增加先升高，在4.0 時達(dá)到最大值，這是因為多酚類化合物含有較多羥基而容易電離出H+，從而呈弱酸性，如果抑制H+電離并保證該成分以分子形式存在，則有利于吸附；但繼續(xù)增加時多酚離子化程度會加深，吸附效果降低，導(dǎo)致純化效率反而下降，故以4.0 為最佳吸附pH 值。

3.2.2 正交試驗 因素水平見表4，結(jié)果見表5，可知各因素影響程度依次為B＞C＞A，最優(yōu)工藝為A3B2C2，為了節(jié)約時間和成本，本實驗選擇吸附時間為2 h。最終確定，最優(yōu)工藝為吸附時間2 h，吸附溫度25 ℃，吸附pH 值4.0。

表4 靜態(tài)吸附工藝正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表5 靜態(tài)吸附工藝正交試驗方差分析

3.2.3 驗證試驗 按“3.2.2” 項下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗證試驗，測得茶多酚平均吸附量為15.25 mg／g，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3.3 靜態(tài)解吸工藝

3.3.1 單因素試驗 由圖2A 可知，茶多酚解吸率隨著解吸時間延長升高，在120 min 時達(dá)到最大值，但繼續(xù)延長時反而略微降低，其原因可能是解吸出的茶多酚又重新吸附到樹脂上，故以120 min 為最佳解吸時間。

圖2 靜態(tài)解吸工藝單因素試驗結(jié)果

由圖2B 可知，茶多酚解吸率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加升高，在70%時達(dá)到最大值，但繼續(xù)增加時有降低趨勢，故以70%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

由圖2C 可知，茶多酚解吸率隨著解吸溫度增加升高，在35 ℃時達(dá)到最大值，但繼續(xù)升高時反而降低，其原因可能是樹脂內(nèi)部分子運動隨著溫度增加先越來越活躍，使茶多酚更易被乙醇洗脫下來，但溫度過高時樹脂容易變性，乙醇容易揮發(fā)，導(dǎo)致解吸效果下降，故以35 ℃為最佳解吸溫度。

3.3.2 正交試驗 因素水平見表6，結(jié)果見表7，可知各因素影響程度依次為C＞A＞B，最優(yōu)工藝為A1B2C2，即解吸時間1.5 h，解吸溫度35 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。

表6 靜態(tài)解吸工藝正交試驗結(jié)果

表7 解吸工藝正交試驗方差分析

3.3.3 驗證試驗 按“3.3.2” 項下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗證試驗，測得茶多酚平均解吸率達(dá)84.91%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3.4 茶多酚純度測定 按“3.2.2” “3.3.2” 項下優(yōu)化工藝純化茶多酚，測得其純度為78.64%。

3.4.1 血糖值 由表8 可知，與空白組比較，模型組小鼠血糖值升高（P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，茶多酚各劑量組小鼠血糖值降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性。

表8 各組小鼠血糖值比較（±s，n＝10）

表8 各組小鼠血糖值比較（±s，n＝10）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別實驗前血糖值／（mmol·L-1）實驗后血糖值／（mmol·L-1）血糖下降率／%空白組7.50±0.596.81±0.939模型組16.10±3.60**19.00±2.10**-18對照組17.94±5.905.60±0.80＃＃69茶多酚低劑量組 15.54±3.589.10±1.14＃41茶多酚中劑量組 11.40±2.015.20±0.77＃＃54茶多酚高劑量組 15.33±5.063.30±0.84＃＃78

3.4.2 臟器指數(shù) 除空白組外，各組小鼠在實驗開始時均會出現(xiàn)眼部細(xì)菌感染，灌胃給藥一段時間后除模型組外均有所減輕。由表9 可知，與模型組比較，茶多酚各劑量組小鼠臟器指數(shù)均有不同程度的改善，以中劑量組更全面（P＜0.05，P＜0.01）。

表9 各組小鼠臟器指數(shù)比較（mg／g，±s，n＝10）

表9 各組小鼠臟器指數(shù)比較（mg／g，±s，n＝10）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別心肝脾腎胸腺空白組0.565±0.0784.848±0.4380.531±0.1781.516±0.1740.441±0.177模型組0.510±0.066*4.847±0.4140.504±0.1861.576±0.201*0.536±0.245*對照組0.516±0.1035.151±0.8330.659±0.348＃1.679±0.215＃0.232±0.101＃＃茶多酚低劑量組0.596±0.013＃4.826±0.3120.793±0.158＃＃1.442±0.1560.347±0.096＃＃茶多酚中劑量組0.603±0.080＃＃4.290±0.358＃0.373±0.128＃1.328±0.151＃0.362±0.101＃＃茶多酚高劑量組0.498±0.0384.751±0.8350.403±0.060＃1.466±0.1660.226±0.037＃＃

4 討論與結(jié)論

本實驗在單因素試驗基礎(chǔ)上采用正交試驗，得到AB-8型大孔吸附樹脂純化六安瓜片茶多酚的最優(yōu)靜態(tài)吸附工藝為溫度25 ℃，pH 值4.0，吸附時間2 h，吸附量達(dá)15.25 mg／g；最優(yōu)靜態(tài)解吸工藝為解吸時間1.5 h，解吸溫度35 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，解吸率達(dá)84.91%，并且工藝環(huán)境友好，設(shè)備可靠，過程安全，經(jīng)濟(jì)有效，便于產(chǎn)業(yè)化。再進(jìn)行3 批驗證試驗，發(fā)現(xiàn)上述工藝穩(wěn)定可靠。

綠茶作為藥食同源、食用更廣的品種，其用量與藥效的關(guān)系是研發(fā)中非常重要的參數(shù)。因此，本實驗以鏈脲佐菌素建立高血糖小鼠模型，考察茶多酚對其血糖、臟器指數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)不同劑量該成分均能顯著降低血糖，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，并且中劑量組對臟器指數(shù)的影響更全面。上述結(jié)果可為其他茶葉產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。