基于UPLC 指紋圖譜和化學計量學的不同熏硫程度白芷質量評價

陳文莉，李 蕊，陳瑞鑫，郭佳晨，蔣桂華

（1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137；2.成都中醫藥大學，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137；3.成都中醫藥大學國學院，四川 成都 611137）

白芷始載于《神農本草經》，其性溫味辛，歸胃、肺、大腸經，具有解表散寒、祛風止痛等功效，臨床常用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛等癥［1］。白芷富含揮發油類、香豆素類、多糖類、黃酮類、生物堿等成分［2-4］。現代研究表明，白芷及其主要活性成分對神經系統疾病如驚厥、偏頭痛、抑郁、止疼等有較好的緩解或治療作用［5-7］。

2020 年版《中國藥典》 收載的白芷成方制劑有八十多個，《中醫方劑大辭典》 中收錄的白芷方劑高達3 887 個［8］。目前市場上的白芷按產地主要分為川白芷、杭白芷、祁白芷、禹白芷、亳白芷；其中川白芷的產量較大，質量上乘；杭白芷近年來基本不再種植；祁白芷、禹白芷產量較小主要供地方使用；亳白芷近年發展迅猛，產量占有較大，市場上多做香料使用。白芷產地加工方式多為硫磺熏蒸，具有易干燥、不易生蟲、經濟簡易等優勢。但現有研究表明，硫磺熏蒸后藥材有效成分含量損失、藥效降低、藥材質量受到嚴重影響［9-11］。2020年版《中國藥典》 規定白芷二氧化硫殘留量不得超過150 mg／kg，但課題組前期調研一百余批白芷樣品后發現，熏硫白芷二氧化硫殘留量差異較大，除2 批藥材符合規定外，其余樣品的二氧化硫殘留量超過規定幾倍甚至十幾倍，這可能是不同熏硫程度所導致。2020 年版《中國藥典》 僅以歐前胡素含量作為白芷質量控制的標準較為單一，無法體現不同熏硫白芷藥材的內在質量差異［12］。

綜上所述，白芷為藥食同源藥材，使用量較大，不同熏硫程度白芷在市場上流通售賣，藥材質量參差不齊，不利于市場監管，也限制了白芷產業的發展。目前針對不同熏硫程度白芷的質量研究尚顯空白，因此本研究擬建立不同熏硫程度白芷UPLC 指紋圖譜方法，篩選出不同熏硫程度白芷差異性標志物；并測定其3 種主要成分含量，以期為熏硫白芷質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Ultimate 3000 超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；SQP 萬分之一電子分析天平、BT125D 十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius 公司）；KQ-300 型超聲波清洗機（昆山市超聲設備有限公司）；SHZ-D （Ⅲ） 循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；Milli-Q 超純水器（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 歐前胡素 （批號MUST-20031810）、佛手柑內酯（批號MUST-20053001）、水合氧化前胡素（批號MUST-20101314）、異歐前胡素 （批號MUST-20032420）、珊瑚菜素 （批號MUST-21060301） 對照品均購于成都曼思特生物科技有限公司；白當歸素（批號AF9021403）、氧化前胡素（批號AF9021403） 購于成都埃法生物科技有限公司，所有對照品純度均大于98%。乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；冰乙酸（色譜純，成都市科隆化學品有限公司）；其余試劑為分析純；水為超純水。

定點收集33 批四川遂寧不同熏硫程度的白芷藥材，經成都中醫藥大學蔣桂華教授鑒定為杭白芷Angelicadahurica（Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.） Shan et Yuan 的干燥根，樣品信息見表1。

表1 樣品信息Tab．1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 月旭Xtimate UHPLC C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%乙酸（B），洗脫程序見表2；體積流量0.35 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長305 nm；進樣量3 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab．2 Procedures for gradient elution

2.2 供試品溶液制備 取白芷粉末（過4 號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（300 W，50 kHz）1 h，靜置放冷后稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.3 對照品溶液制備 取白當歸素、氧化前胡素、異歐前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素、佛手柑內酯、水合氧化前胡素對照品適量，精密稱定，加甲醇稀釋成質量濃度分別為81.0、75.0、80.0、87.0、80.0、75.0、93.0 μg／mL 的對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取“2.3” 項下對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，以歐前胡素（9 號峰） 為參照峰，測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值均小于1%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取白芷粉末（S6） 適量，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，以歐前胡素（9 號峰） 為參照峰，測得各共有峰的相對保留時間RSD 值均小于1%，相對峰面積RSD 值均小于2%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取白芷粉末（S6） 適量，按“2.2” 項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，以歐前胡素（9 號峰） 為參照峰，測得各共有峰的相對保留時間的RSD 值均小于1%，相對峰面積的RSD 值均小于2%，表明該方法重復性良好。

2.5 UPLC 指紋圖譜的建立 將33 批白芷按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。原始數據以txt 文件格式導出后，導入Origin 2018 軟件進行繪圖。色譜圖見圖1。供試品色譜圖與對照品色譜峰進行比對，指認出7 種成分，分別為水合氧化前胡素、白當歸素、佛手柑內酯、氧化前胡素、歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素，見圖2。

圖1 不同熏硫程度白芷藥材UPLC 指紋圖譜Fig．1 UPLC fingerprints for differently sulfurfumigated Angelicae dahuricae Radix

圖2 各成分UPLC 色譜圖Fig．2 UPLC chromatogran of various constituents

2.6 相似度評價 將33 批白芷樣品色譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統 （2012版） 》，以S6 為參照，計算相似度，結果見表3。不同熏硫程度白芷樣品色譜圖與參照圖譜的相似度為0.735～0.997。結果顯示，無硫和低硫白芷相似度均高于0.950；中硫白芷除S32 外，相似度均低于0.950；高硫白芷除S33 外，相似度均低于0.900。表明不同熏硫程度白芷質量差異較大，通過相似度評價可以進行初步區分。

表3 不同熏硫程度白芷指紋圖譜相似度結果Tab．3 Results for fingerprint similarity of differently sulfur-fumigated Angelicae dahuricae Radix

2.7 聚類分析 采用SPSS 26.0 軟件，以11 個共有峰的峰面積為變量，采用組間聯接的聚類方法，以歐式距離為樣品距離進行聚類，結果見圖3。在度量距離為25 時，白芷樣品整體分為2 類；當度量距離為17 時，白芷樣品被分為3 類，S1～S13 無硫和低硫白芷聚為Ⅰ類，S14～S18 中硫白芷聚為Ⅱ類，S19～S33 聚為Ⅲ類。結果表明，聚類分析有分類趨勢，同一熏硫程度的白芷大多被聚為一類，但也存在部分樣品分類不準確的現象，因此需要引入有監督的模式識別。

圖3 不同熏硫程度白芷藥材聚類分析樹狀圖Fig．3 Dendrogram of differently sulfur-fumigated Angelicae dahuricae Radix

2.8 主成分分析 將33 批白芷共有峰峰面積導入SPSS 26.0 軟件，以共有峰峰面積為變量進行主成分分析。提取標準為特征值大于1，結果見表4。共提取3 種主成分，方差貢獻率、累計貢獻率為84.403%，表明這11 個共有峰可代表白芷指紋圖譜的大部分信息。

表4 主成分分析特征值和方差貢獻率Tab．4 PCA eigenvalues and variance contribution rate

主成分載荷矩陣反應了各峰對主成分的貢獻大?。黄浣^對值越大，表明該峰對主成分的貢獻越高，主成分因子載荷矩陣結果可見表5。由表5 可知，峰9 （歐前胡素）、峰6 （佛手柑內酯）、峰10（珊瑚菜素） 對第一主成分有較大的貢獻值。

表5 主成分因子載荷矩陣Tab．5 Principal component load

采用SIMCA 14.1 軟件，對33 批白芷樣品進行主成分分析，提取了4 種主成分建立PCA 模型，結果見圖4。模型解釋參數R2X為0.919，表示提取的主成分可解釋91.9% 的原始變量，模型預測參數Q2為0.709。樣品總體可分為4 類，與聚類分析結果不一致，在聚類分析的基礎上可將無硫白芷區分開來；表明不同熏硫程度白芷化學成分含量存在一定差異，且該模型預測性良好，可以實現不同熏硫程度白芷的區分。

圖4 不同熏硫程度白芷的PCA 散點圖Fig．4 PCA score plot of differently sulfurfumigated Angelicae dahuricae Radix

2.9 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA） 為進一步尋找引起不同熏硫程度白芷差異的標志物，將共有峰數據導入SMICA 14.1 軟件，建立模型，OPLS-DA 得分散點圖見圖5。白芷模型解釋率參數R2X為0.840，R2Y為0.788，預測參數Q2為0.806，均大于0.5 且接近1，表明建立的模型穩定可靠。

圖5 不同熏硫程度白芷的OPLS-DA 得分散點圖Fig．5 OPLS-DA analysis results of differently sulfurfumigated Angelicae dahuricae Radix

為防止模型過度擬合造成假陽性結果，采用置換檢驗（n＝200） 對模型進行驗證，置換檢驗圖見圖6。結果顯示，白芷檢驗參數R2＝（0.0，0.056），Q2＝（0.0，-0.34），R2均小于0.40，Q2均小于0.05，表明所建模型擬合良好。

圖6 不同熏硫程度白芷的OPLS-DA 置換檢驗圖Fig．6 OPLS-DA permutation test of differently sulfur-fumigated Angelicae dahuricae Radix

OPLS-DA 模型中變量重要性投影值（VIP 值）可直觀反映出具有統計學意義的差異標志物；VIP值越大，表明其對組間差異的影響權重越大。以VIP 值大于1 為閾值，篩選出5 個共有峰，見圖7，分別為峰1、峰8、峰7 （氧化前胡素）、峰5、峰3 （水合氧化前胡素）；表明這些化合物可能是影響不同熏硫程度白芷質量差異的標志物。

圖7 11 個共有峰VIP 值Fig．7 VIP values of eleven common peaks

2.10 主成分含量測定

2.10.1 線性關系考察 精密稱取歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素對照品適量，加甲醇制成質量濃度為184、86、86 μg／mL 的對照品溶液。精密吸取對照品溶液1、3、6、12、15、18 μL，在“2.1” 色譜條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表6，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表6 各成分線性關系Tab．6 Linear relationships of various constituents

2.10.2 精密度試驗 取“2.10.1” 項下對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6次，測得歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素峰面積RSD 分別為0.26%、0.91%、0.76%，表明該儀器精密度良好。

2.10.3 重復性試驗 取白芷粉末（S6） 6 份，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素峰面積RSD 分別為0.54%、0.66%、0.90%，表明該方法重復性良好。

2.10.4 穩定性試驗 取白芷粉末（S6） 適量，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、3、6、9、12、18、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素峰面積RSD 分別為0.15%、0.15%、0.92%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.10.5 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的白芷粉末（S6） 0.5 g，精密稱定，按對照品與樣品1 ∶1 的比例，加入歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素對照品，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液6 份，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素平均加樣回收率為100.93%、98.36%、96.78%，RSD 分別為2.72%、1.85%、2.32%，見表7。

表7 各成分加樣回收率結果（n＝6）Tab．7 Results of recovery rates for various constituents（n＝6）

2.10.6 含量測定 取33 批白芷，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表8。

表8 各成分含量測定結果（mg／g，n＝3）Tab．8 Results of content determination for various constituents （mg／g，n＝3）

3 討論

目前，白芷HPLC 指紋圖譜或一測多評研究較多［13-14］，但采用超高效液相色譜的研究較少。因此，選擇超高效液相色譜技術進行研究，一方面是為填補空白，其次是為縮短進樣時間提高檢測效率。本研究建立了不同熏硫程度白芷UPLC 指紋圖譜方法，標定了峰面積較高的11 個共有峰，指認了7 個共有峰，在已有的基礎上豐富了不同熏硫程度白芷的共有成分［15-17］；同時，通過OPLS-DA 分析篩選出5 種差異性成分，并用對照品比對出氧化前胡素、水合氧化前胡素可作為不同熏硫程度白芷的質量差異物。2020 年版《中國藥典》 “白芷”含量測定僅以歐前胡素為指標較為單一，建議后續可以增加其他共有成分或差異性成分作為測試指標，以利于更加科學的評價白芷質量。已有文獻報道白芷熏硫后損失最大的是氧化前胡素，其次為水合氧化前胡素［18］，與本研究結果一致，能評價不同熏硫程度白芷的整體質量。

含量測定結果顯示，33 批白芷藥材的3 種主要成分（歐前胡素、珊瑚菜素、異歐前胡素） 的含量在0.864～4.791 mg／g 之間。其中，無硫白芷的這3 種成分總含量最高，而高硫白芷的總含量最低；這可能是熏硫過程中硫磺使用量過大、熏硫時間過長所導致的有效成分含量降低。中藥成分復雜，不同加工方式將會影響藥材質量，因此通過多指標的含量測定來評價藥材質量是十分有必要的。

2020 年版《中國藥典》 中除對山藥、天冬、天花粉、天麻、牛膝、白及、白術、白芍、黨參、粉葛共10 味藥材及其飲片“二氧化硫殘留量” 檢查限度標準為400 mg／kg 外；其余中藥材及飲片二氧化硫殘留量不得超過150 mg／kg。彭月［19］對市購的山藥、葛根、黃芪、黨參等88 批藥材的二氧化硫殘留量進行測定，與限度標準對比，僅約四分之一的樣品符合限量要求。硫磺熏蒸最初用以防腐防蟲達到利于貯藏的目的，現在部分不良商家濫用硫磺熏蒸用于藥材漂白，嚴重影響藥材用藥安全［20］。本研究以白芷為例，運用指紋圖譜結合化學模式識別的方法對不同熏硫程度白芷樣品進行質量評價研究，也為其他熏硫藥材的評價提供參考。