甘草查爾酮A 對結腸癌細胞中氧化還原穩態調控的影響

丁舒飛，蔣東曉，邱璐琦，張蘇宏，阮葉萍*

（1.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江省中山醫院，浙江 杭州 310005；3.蘇州百遏醫藥科技有限公司，江蘇 蘇州 215000）

結腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，具有較高的發病率和死亡率［1］。據《中國大腸癌流行病學及其預防和篩查白皮書》 顯示，我國大腸癌的發病率持續增長，且絕大部分患者被發現時已經是Ⅱ期或晚期。盡管臨床上已采用早期篩查、手術、化療等手段來治療結腸癌，但是結腸癌致死的人數仍然很高［2］，使得患者的生活質量未得到有效改善。

活性氧（reactive oxygen species，ROS） 是一種有力的致癌物，近年來研究發現ROS 抑制劑卻能促進部分腫瘤的生長和轉移［3-4］。正是因為腫瘤細胞較正常細胞具有較高的基礎ROS 水平，使得腫瘤細胞更加依賴抗氧化系統，對ROS 水平的上升會更加敏感［5］。因此，以上調腫瘤ROS 水平為導向對尋找抗癌藥物有著重要意義。

天然產物具有療效高且副作用小的優勢，是篩選抗癌藥物的重要來源。甘草查爾酮A 是從甘草中提取的一種黃酮類化合物，藥理活性廣泛，目前其抗腫瘤活性最受關注。研究發現甘草查爾酮A能通過阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡方式抑制多種腫瘤的生長［6-7］，且能通過上調ROS 水平抑制結腸癌的生長［8］，但具體作用靶點則并不明確。本研究將進一步驗證甘草查爾酮A 的抗癌能力，并探究其誘導結腸癌細胞凋亡的作用靶點，以期為甘草查爾酮A 應用于臨床提供理論依據。

1 材料

1.1 細胞株 人結腸癌細胞SW480、HCT116 均由蘇州奧特銘醫藥科技有限公司贈予。HCT116 細胞和SW480 細胞均培養在含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 高糖培養基中，放置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。

1.2 藥物與試劑 甘草查爾酮A （成都普瑞法科技開發有限公司，貨號BP0855，純度≥98%）。DMEM 高糖培養基 （美國 Gibco 公司，貨號C11995500BT）；噻唑藍 （methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-Lcysteine，NAC） （美國Sigma 公司，貨號M21282、A7250）；FITC Annexin V 凋亡試劑盒（美國BD 公司，貨號556547）；Annexin V-APC／7-ADD 試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司，貨號AP105）；硫氧還蛋白還原酶1 （thioredoxin reductase 1，TrxR1） 重組蛋白 （美國 Abnova 公司，貨號P3509）；RIPA 裂解液、活性氧檢測試劑盒、DHE探針 （上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0013C、S0033、S0063）；cleaved-PARP 多克隆兔抗體、β-actin 多克隆兔抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號A19612、AC038）；Bcl-2 多克隆兔抗體、TrxR1 多克隆兔抗體、HRP 標記羊抗兔二抗、ECL 顯色液、GAPDH 多克隆兔抗體（美國Affinity 公司，貨號AF6139、DF8339、S0002、KF001、AF7021）；還原型谷胱甘肽 （reduced glutathione，GSH） 含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號BC1175）；丁硫氨酸亞砜胺（buthionine sulfoximine，BSO）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR） （上海源葉生物科技有限公司，貨號S51087、S10151）。

1.3 儀器 生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，型號BCM-1000A）；酶標儀 （美國BioTek 公司，型號Power Wave X340）；臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司，型號Centrifuge 5430R）；熒光倒置顯微鏡、光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號1X71、CX31）；流式細胞儀（美國Beckman 公司，型號CytoFLEX S）；電泳儀、化學發光凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司，型號Power Pac Basic 164-5050、ChemiDoc Touch）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測細胞存活率 取對數生長期結腸癌細胞，以每孔6 000 個的密度接種于96 孔板，設甘草查爾酮A 不同濃度梯度（0、5、10、20、30、40 μmol／L），每組3 個復孔。培養24 h 后棄原培養基，每孔加入100 μL MTT （0.5 mg／mL），繼續孵育4 h，棄培養基，每孔避光加入150 μL DMSO 溶液，搖床上振蕩10 min。于490 nm 波長處測各孔的光密度（OD） 值，計算細胞存活率。選用光學顯微鏡觀察甘草查爾酮A 對結腸癌細胞形態的改變。

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數生長期結腸癌細胞，以每孔6×105個的密度接種于6 孔板，待細胞貼壁后分為3 組，分別為對照組和20、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組。按分組進行加藥處理，孵育24 h 后收集細胞，PBS 清洗1～2 次，按FITC Annexin V 凋亡試劑盒說明書操作，過300 目尼龍篩，上機檢測。另設4 組，分別為對照組、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組、40 μmol／L 甘草查爾酮A+5 mmol／L NAC 組、5 mmol／L NAC 組，其余操作同上。另設4 組，分別為對照組、20 μmol／L 甘草查爾酮A 組、20 μmol／L 甘草查爾酮A+10 mmol／L BSO 組、10 mmol／L BSO 組，其余操作同上。另設4 組，分別為NC 組、NC+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組、TrxR1-shRNA 組、TrxR1-shRNA+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組，細胞凋亡率按Annexin V-APC／7-ADD 試劑盒說明書進行操作，其余同上。

2.3 Western blot 法檢測凋亡相關蛋白表達 取對數生長期結腸癌細胞，以每孔1×106個的密度接種于6 孔板，待細胞貼壁后分為3 組，分別為對照組和20、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組。按分組進行加藥處理，孵育24 h 后用RIPA 裂解液裂解并提取蛋白，BCA 定量試劑盒檢測各組蛋白濃度。取等量蛋白上樣，經SDS-PAGE 凝膠電泳分離，濕轉到PVDF 膜。5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，剪膜后加入相對應的一抗，于4 ℃孵育過夜，洗膜，加HRP標記羊抗兔二抗于37 ℃孵育2 h，洗膜，加電化學發光反應液，于化學發光數字成像系統顯影，通過Image J 軟件分析目的條帶灰度值。以目標蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值為蛋白相對表達。另設4 組，分別為對照組、40 μmol／L 甘草查爾酮A組、40 μmol／L 甘草查爾酮A+5 mmol／L NAC 組、5 mmol／L NAC 組，其余操作同上。

2.4 流式細胞術檢測ROS 水平 取對數生長期HCT116 細胞，以每孔1×106個的密度接種于6 孔板，待細胞貼壁后分為3 組，分別為對照組和20、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組。按分組進行加藥處理，孵育24 h 后收集細胞，用不含胎牛血清的培養基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol／L，調整細胞密度為1×106～2×107／mL，置于細胞培養箱中孵育20 min。PBS 清洗細胞2～3 次后重懸細胞，過300 目尼龍篩網至流式管，選擇流式細胞儀FITC-A 通道檢測熒光強度。DHE 探針操作同DCFH-DA，選擇流式細胞儀PC-5.5A 通道檢測熒光強度。另設4 組，分別為對照組、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組、40 μmol／L 甘草查爾酮A +5 mmol／L NAC 組、5 mmol／L NAC 組，其余操作同上。另設4 組，分別為NC 組、NC+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組、TrxR1-shRNA 組、TrxR1-shRNA+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組，采用DHE 探針檢測ROS 水平，其余操作同上。

2.5 分子對接 通過PDB 數據庫下載目標蛋白PDB 文件，PubChem 數據庫下載小分子SDF 文件，通過Schrodinger 軟件對蛋白和小分子分別進行預處理，將蛋白處理生成格點文件后再進行對接。

2.6 TrxR1 活性檢測 通過DTNB 法，將NADPH預還原的重組TrxR1 蛋白（170 nmol／L） 與不同濃度甘草查爾酮A （0、5、10、20、40、80、100 μmol／L） 加入到96 孔板中，于室溫下孵育0.5 h，加入50 μL 含DTNB （終濃度2 mmol／L） 和NADPH （終濃度0.2 mmol／L） 的TE 緩沖液于每孔中，立即檢測前3 min 內在412 nm 波長處的吸光度的增加量。細胞中的TrxR1 活性利用胰島素終點法進行測定。

2.7 GR 活性檢測 將NADPH 還原的重組蛋白GR （0.25 U／mL） 與不同濃度甘草查爾酮A （0、5、10、20、40、80、100 μmol／L） 加入到96 孔板中，所有反應在TE 緩沖體系中進行，在室溫下孵育0.5 h，加入50 μL 含氧化型谷胱甘肽（終濃度1 mmol／L） 和NADPH （終濃度0.4 mmol／L） 的TE 緩沖液，立即檢測前3 min 內在340 nm 波長處的吸光度。細胞中的GR 活性利用谷胱甘肽還原酶試劑盒進行檢測。

2.8 慢病毒感染實驗 將HCT116 細胞接種至96孔板中，培養過夜，使感染前細胞匯合率在30%～50%之間。設置感染復數（multiplicity of Infection，MOI） 梯度值（0、1、5、10、20、40、80），選擇最佳MOI 值。根據MOI 值稀釋攜帶無關序列或TrxR1 沉默序列的慢病毒并加到96 孔板中，24 h后更換新鮮完全培養基，繼續培養。感染72 h 后可在熒光顯微鏡下觀察感染效率。再根據實驗結果選擇適宜的MOI 值，重復以上步驟并用嘌呤霉素篩選細胞，獲取穩轉株用于實驗。其中MOI＝慢病毒滴度×慢病毒體積／細胞數目。

2.9 細胞內GSH 水平檢測 細胞以每孔1×106個的密度接種于6 孔板并培養過夜，待細胞貼壁后分為3 組，分別為對照組和20、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組。按分組進行加藥處理，孵育24 h 后，PBS 清洗2～3 次，加入3 倍細胞沉淀體積的試劑重懸細胞，反復凍融2～3 次，8 000 r／min 離心10 min，收集上清按GSH 含量檢測試劑盒說明書檢測GSH 水平。

2.10 統計學分析 通過Graph Pad Prism 8.0 和SPSS 17.0 軟件進行處理，實驗數據以（±s） 表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 甘草查爾酮A 對細胞存活的影響 如圖1A所示，給藥24 h 后，與對照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A） 比較，5～40 μmol／L 甘草查爾酮A 均能有效抑制HCT116 細胞和SW480 細胞的活性（P＜0.05，P＜0.01）。后續實驗選擇甘草查爾酮A 進行。如圖1B 所示，與對照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A） 比較，20、40 μmol／L 甘草查爾酮A 組HCT116 細胞和SW480 細胞均可見空泡化、變圓、體積變小的現象。

圖1 甘草查爾酮A 對結腸癌細胞活性（A） 和形態（B） 的影響（±s，n＝3）Fig．1 Effects of licochalcone A on viability （A） and morphology （B） of colon cancer cells （±s，n＝3）

3.2 甘草查爾酮A 對結腸癌細胞凋亡的影響 如圖2A 所示，與對照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A）比較，HCT116 細胞和SW480 細胞經各濃度甘草查爾酮A 處理后，細胞凋亡率均升高（P＜0.05，P＜0.01）。如圖2B～2C 所示，與對照組（0 μmol／L甘草查爾酮A） 比較，經20 μmol／L 甘草查爾酮A處理后，HCT116 細胞和SW480 細胞凋亡蛋白cleaved-PARP 表達升高 （P＜0.05，P＜0.01），SW480 細胞抗凋亡蛋白Bcl-2 表達降低（P＜0.01）；經40 μmol／L 甘草查爾酮A 處理后，HCT116 細胞和SW480 細胞cleaved-PARP 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.01）。

圖2 甘草查爾酮A 對結腸癌細胞凋亡的影響（±s，n＝3）Fig．2 Effects of licochalcone A on apoptosis of colon cancer cells （±s，n＝3）

3.3 甘草查爾酮A 對結腸癌細胞ROS 水平的影響 如圖3A～3B 所示，與對照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A） 比較，HCT116 細胞和SW480 細胞在流式細胞儀FITC-A 通道和PC-5.5A 通道的熒光強度均有增強，ROS 水平均有所上升（P＜0.01）。NAC是一種常見的ROS 抑制劑，如圖3C～3D 所示，與單純給予甘草查爾酮A 比較，甘草查爾酮A 聯合NAC （預孵育6 h） 給藥后兩結腸癌細胞內的ROS水平下降（P＜0.01）。說明ROS 抑制劑能逆轉甘草查爾酮A 誘導的結腸癌細胞ROS 水平的上升。

圖3 甘草查爾酮A 對結腸癌細胞ROS 水平的影響（±s，n＝3）Fig．3 Effects of licochalcone A on ROS level in colon cancer cell （±s，n＝3）

3.4 ROS 抑制劑對甘草查爾酮A 誘導結腸癌細胞凋亡的影響 如圖4 所示，與40 μmol／L 甘草查爾酮A 組比較，40 μmol／L 甘草查爾酮A+NAC 誘導的HCT116 細胞和SW480 細胞凋亡率降低 （P＜0.01），cleaved-PARP 蛋白表達降低。

圖4 ROS 抑制劑對甘草查爾酮A 誘導結腸癌細胞凋亡的影響（±s，n＝3）Fig．4 Effects of ROS inhibitor on licochalcone A-induced apoptosis of colon cancer cells （±s，n＝3）

3.5 甘草查爾酮A 對GR 和TrxR1 活性的影響酶學實驗結果如圖5A 所示，與對照組比較，5～100 μmol／L 甘草查爾酮A 均能抑制重組蛋白TrxR1的活性，并呈劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01），而對重組GR 蛋白活性則幾乎無影響（P＞0.05）。如圖5B～5C 所示，與對照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A） 比較，5～100 μmol／L 甘草查爾酮A 能有效抑制結腸癌細胞中TrxR1 活性 （P＜0.05，P＜0.01），而對結腸癌細胞中GR 活性無明顯影響（P＞0.05）。以上結果表明，甘草查爾酮A 能選擇性地抑制還原蛋白TrxR1 的活性。

圖5 甘草查爾酮A 對GR 和TrxR1 活性的影響（±s，n＝3）Fig．5 Effects of licochalcone A on GR and TrxR1 activities （±s，n＝3）

3.6 甘草查爾酮A 對TrxR1 蛋白表達的影響及分子對接驗證 如圖6A 所示，與對照組（0 μmol／L甘草查爾酮A） 比較，經甘草查爾酮A 處理后，HCT116 細胞和SW480 細胞TrxR1 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05）。如圖6B 所示，甘草查爾酮A 能和TrxR1 蛋白（PDB code 2ZZ0） 中的Trp 407 形成2 個氫鍵相互作用，甘草查爾酮A 的α，β 雙鍵能進攻TrxR1 的Cys 498 殘基并與Cys 498 殘基相結合。

圖6 甘草查爾酮A 對TrxR1 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig．6 Effects of licochalcone A on TrxR1 protein expression （±s，n＝3）

3.7 沉默TrxR1 對甘草查爾酮A 干預HCT116 細胞ROS 水平的影響 如圖7A 所示，shRNA 序列1（sh1，CACAGGATTAAGGCAACAAAT） 的沉默效果優于 shRNA 序列 2 （sh2，GCTGGATTTCTT GCTGGTATT） 和shRNA 序列3 （sh3，CTGTATTT ACTCCTTTGGAAT），因此選擇sh1 探究沉默TrxR1對甘草查爾酮A 抗結腸癌作用的影響。如圖7B 所示，與NC+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組比較，沉默TrxR1 能促進甘草查爾酮A 上調HCT116 細胞ROS水平（P＜0.01），對甘草查爾酮A 上調ROS 水平具有協同效果。

圖7 沉默TrxR1 對甘草查爾酮A 干預HCT116 細胞ROS 水平的影響（±s，n＝3）Fig．7 Effects of TrxR1 silencing on ROS level of licochalcone A-intervened HCT116 cells （±s，n＝3）

3.8 沉默TrxR1 對甘草查爾酮A 干預HCT116 細胞活力和凋亡的影響 如圖8 所示，與NC+20 μmol／L 甘草查爾酮A 組比較，沉默TrxR1 后甘草查爾酮A 誘導HCT116 細胞凋亡率升高 （P＜0.01），細胞活力降低（P＜0.05）。結果表明，沉默TrxR1 能促進甘草查爾酮A 誘導HCT116 細胞凋亡及抑制細胞活力。

圖8 沉默TrxR1 對甘草查爾酮A 干預HCT116 細胞活力（A） 和凋亡（B） 的影響（±s，n＝3）Fig．8 Effects of TrxR1 silencing on cell viability （A） and apoptosis （B） of licochalcone A-intervened HCT116 cells （±s，n＝3）

3.9 BSO 對甘草查爾酮A 誘導HCT116 細胞凋亡的影響 如圖9A 所示，與對照組（0 μmol／L 甘草查爾酮A） 比較，甘草查爾酮A 不影響HCT116 細胞中GSH 水平（P＞0.05）。如圖9B 所示，與20 μmol／L 甘草查爾酮A 組比較，甘草查爾酮A 聯合BSO （預孵育4 h） 能促進甘草查爾酮A 誘導HCT116 細胞發生凋亡（P＜0.01）。

圖9 BSO 對甘草查爾酮A 誘導HCT116 細胞凋亡的影響（±s，n＝3）Fig．9 Effects of BSO on apoptosis of licochalcone A-induced HCT116 cells （±s，n＝3）

4 討論

本研究發現，甘草查爾酮A 能誘導HCT116 細胞和SW480 細胞發生凋亡并上調ROS 水平，ROS抑制劑能逆轉甘草查爾酮A 引起的ROS 水平上升和促凋亡作用。甘草查爾酮A 能選擇性地抑制TrxR1 蛋白活性，對TrxR1 蛋白表達幾乎沒有影響，且沉默TrxR1 使結腸癌細胞對甘草查爾酮A干預更加敏感，表明TrxR1 在甘草查爾酮A 抗結腸癌過程中發揮著重要作用。

谷胱甘肽系統和硫氧還蛋白系統是機體內防御氧化應激的關鍵抗氧化系統。近年來，研究發現哺乳動物的硫氧還蛋白系統和谷胱甘肽系統能夠交叉提供電子，并互為后備系統［5，9］。當硫氧還蛋白系統中TrxR1 缺失時，使腫瘤對藥物性谷胱甘肽缺乏高度敏感［10］。本研究發現，沉默TrxR1 對HCT116細胞ROS 水平的升高、細胞活性以及凋亡幾乎沒有影響，進一步說明了細胞內存在TrxR1 的備用系統，能繞過TrxR1 缺陷繼續維持細胞內的氧化還原平衡。GSH 是谷胱甘肽系統中的抗氧化劑，能與氧化劑發生非酶促反應，抑制細胞內的氧化應激［11］。本研究發現，甘草查爾酮A 不影響GSH 水平，GSH 抑制劑BSO 則能協同甘草查爾酮A 誘導HCT116 細胞發生凋亡，間接說明了TrxR1 可介導甘草查爾酮A 誘導結腸癌細胞發生凋亡。

TrxR1 是一種NADPH 依賴的包含黃素腺嘌呤二核苷酸結構域的二聚體含硒酶，廣泛分布于原核細胞和各類生物體細胞中。TrxR1 的表達與腫瘤的生長和預后密切相關［12-13］，越來越多實驗證明，通過靶向抑制TrxR1 活性可有效抑制多種腫瘤細胞的生長，如胃癌、肝癌、結腸癌等［14-16］，且沉默TrxR1 能夠增加藥物對腫瘤細胞的殺傷作用［17］。本研究同樣發現，沉默TrxR1 能夠協同甘草查爾酮A 的抗結腸癌作用，可見TrxR1 是開發抗癌藥物中非常有價值的靶點。TrxR1 的C 末端-Gly-Cys-Sec-Gly 是氧化還原活性位點［18］。研究發現，含有α，β-不飽和酮結構的化合物，容易和TrxR1 蛋白晶體結構（Sec 498 殘基被Cys 498 殘基） 的Cys 498 殘基發生共價結合，如EF24 和B19［14，19］。本研究發現，含有上述結構的甘草查爾酮A 同樣能與TrxR1蛋白晶體結構內的Cys 498 殘基以共價鍵的形式結合。Sec 殘基比典型的Cys 殘基親核性高3 個數量級，對親電物種有著高度反應［20］。另有研究發現，含有上述結構的紫草素能抑制TrxR1 活性，對U498C TrxR1 （Sec 498 殘基被Cys 498 殘基） 活性幾乎無影響［3］。說明TrxR1 活性的降低有可能與甘草查爾酮A 作用TrxR1 活性位點Sec 有關，而甘草查爾酮A 和Sec 的共價結合是否可逆則有待進一步研究。

綜上所述，甘草查爾酮A 可能通過抑制TrxR1活性來破壞結腸癌細胞內的氧化還原穩態，進而誘導結腸癌細胞發生凋亡。本研究為甘草查爾酮A應用于結腸癌的治療提供了理論依據，為抗結腸癌藥物靶點的開發提供了新思路。