消渴健脾膠囊制備工藝、質量標準研究

丁然然，楊明霞，何承輝，馬美玲

（1.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830054；2.烏魯木齊市中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830099；3.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004）

消渴健脾膠囊由蒼術、白術等13 味中藥組成，具有行氣和胃、燥濕健脾等功效，為烏魯木齊市中醫醫院國家級名老中醫許公平主任的臨床經驗方，至今已有二十余年臨床應用歷史，用于治療脾虛濕盛型2 型糖尿病［1-2］，可調節糖尿病患者炎性因子，減輕胰島素抵抗，改善形體肥胖、身體困倦、頭脹、脈沉等脾虛濕盛型證候，提高生活質量［3-5］。為了滿足醫院臨床需要，本實驗以中醫藥理論為指導，根據國家食品藥品監督管理總局關于對醫療機構應用傳統工藝配置中藥制劑實施備案管理公告（2018 年第19 號） 的要求，開展消渴健脾膠囊臨床前藥學研究工作。另外，課題組前期曾將制備工藝更改為部分藥材水提取，部分藥材乙醇提取，部分藥材提取揮發油，但專家認為消渴健脾膠囊原工藝已有多年臨床實踐支撐，療效顯著，安全可靠，建議維持原工藝，故本實驗在原制備工藝基礎上進行［6-7］。

查閱文獻［8-12］ 發現，消渴健脾膠囊中綠原酸、葛根素、大豆苷、毛蕊花糖苷、落新婦苷、丹酚酸B、大豆苷元是主要降糖活性成分，并且含量較高，常作為質量控制指標。因此，本實驗建立HPLC 法同時測定上述成分的含量，以期控制消渴健脾膠囊中茵陳、葛根、車前子、土茯苓、丹參質量，并為該制劑質量標準研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260、Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗機（鄭州長城科工貿有限公司）；WP-UP-IV-10 Water Purifier 型實驗室專用超純水機（四川沃特爾科技發展有限公司）；DZF-6090 型真空干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品 茯苓、梔子均購自新疆眾安康中藥飲片有限公司（批號20200802、20200403）；木瓜、丹參、茵陳均購自安徽濟善堂中藥科技有限公司（批號200801、200901、200501）；蒼術、大黃均購自安徽人民中藥飲片有限公司（批號190701、190801）；萊菔子、厚樸均購自新疆鴻德堂永盛藥業有限公司（批號200601、200901）；葛根、白術均購自安徽家和中藥科技股份有限公司 （批號191104、200601）；車前子購自毫州市華云中藥飲片有限公司（批號190601）；土茯苓購自安國市祁澳中藥飲片有限公司（批號2007839113），經新疆醫科大學田樹革教授鑒定為正品。落新婦苷對照品購自上海中藥標準化研究中心（批號30-2017）；梔子苷對照品、梔子對照藥材、大黃酚對照品、大黃對照藥材、丹參對照藥材、葛根素對照品均購自中國食品藥品檢定研究院（批號120986-201610、120986-201510、110758-201507、120902-201311、121117-201608、110752-201813）；大豆苷、大豆苷元、毛蕊花糖苷、丹酚酸B 、綠原酸對照品均購自四川省維克奇生物科技有限公司 （批號wkq21041310、wkq21120208、wkq20042004、wkq 21010705、wkq20081302）。

1.3 試劑與藥物 消渴健脾膠囊 （批號20210103，純度82%） 由烏魯木齊市中醫醫院藥劑科提供。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 制備工藝研究

2.1 落新婦苷含量測定 采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 COSMOSIL packed Column 5C18-MS-Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1% 冰醋酸 （37 ∶ 63）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長291 nm。理論塔板數按落新婦苷峰計算，應不低于5 000［13］。色譜圖見圖1。

圖1 落新婦苷HPLC 色譜圖Fig．1 HPLC chromatograms of astilbin

2.1.2 對照品溶液制備 取落新婦苷對照品適量，甲醇溶解，搖勻，稀釋至刻度，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 按本品處方比例，稱取蒼術、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜適量，置于2 000 mL 量瓶中，加10 倍量水，置于調溫電熱套中加熱回流提取1 h，提取液過濾后置于2 000 mL 量瓶中，濾渣加8 倍量水提取45 min，提取液過濾后置于2 000 L量瓶中，合并提取液，加水定容至刻度，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 按本品處方比例，制成缺土茯苓的陰性樣品，按“2.1.3” 項下方法制備，即得。

2.2 梔子苷含量測定 采用HPLC 法。

2.2.1 色譜條件 COSMOSIL packed Column 5C18-MS-Ⅱ色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-水（13 ∶87）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長238 nm。理論塔板數按梔子苷峰計，應不低于1 500［14］。色譜圖見圖2。

圖2 梔子苷HPLC 色譜圖Fig．2 HPLC chromatograms of gardenoside

2.2.2 對照品溶液制備 取梔子苷對照品適量，甲醇溶解，搖勻，稀釋至刻度，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取“2.1.3” 項下提取液適量，上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 按本品處方比例，制成缺梔子的陰性樣品，按“2.1.3” 項下方法制備，即得。

2.3 水浸出物含量測定 精密吸取提取液50 mL，置于干燥至恒定質量的蒸發皿中，水浴蒸干，置于105 ℃烘箱中干燥3 h 至恒定質量，取出，迅速置于干燥器中，冷卻，稱定質量，計算含量。

2.4 單因素試驗 以加水量、提取時間、提取次數為影響因素，梔子苷、落新婦苷、水浸出物含量為評價指標，最大權重分別設定為40、40、20，計算綜合評分，公式為綜合評分＝（梔子苷含量／最大梔子苷含量） ×40+ （落新婦苷含量／最大落新婦苷含量） ×40+ （水浸出物含量／最大水浸出物含量） ×20。

2.4.1 加水量 按本品處方比例，稱取蒼術、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜適量，平行4 份，分別加入8、10、12、14 倍量水各回流提取2 次，每次1 h，提取液過濾后置于2 000 mL 量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，吸取適量，過0.22 μm 微孔濾膜，取續濾液，測定落新婦苷、梔子苷、水浸出物含量，結果見表1。由此可知，綜合評分隨著加水量增加呈升高趨勢，為8 倍量以上時大于90 分，故選擇8、10、12 倍量水進行正交試驗。

表1 加水量單因素試驗結果Tab．1 Results of single factor tests for water addition

2.4.2 提取時間 按本品處方比例，稱取蒼術、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜適量，平行4 份，加10 倍量水分別提取0.5、1、1.5、2 h 各2 次，提取液合并后置于2 000 mL 量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，取續濾液，測定落新婦苷、梔子苷、水浸出物含量，結果見表2。由此可知，綜合評分隨著提取時間延長先升后降，表明時間過長會降低提取效率，故選擇0.5、1、1.5 h 進行正交試驗。

表2 提取時間單因素試驗結果Tab．2 Results of single factor tests for extraction time

2.4.3 提取次數 按本品處方比例，稱取蒼術、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜適量，平行4 份，置于圓底燒瓶中，分別編號1、2、3、4，其中1 號樣品加1 508 mL 水提取1 次，共2 h；2 號樣品加754 mL 水提取2 次，每次1 h；3 號樣品第1、2 次各加528 mL 水分別提取1、0.5 h，第3 次加452 mL 水提取0.5 h，提取液過濾后置于2 000 mL 量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，取續濾液，測定落新婦苷、梔子苷、水浸出物含量，結果見表3。由此可知，提取2 次時綜合評分最高，故選擇1、2、3 次進行正交試驗。

表3 提取次數單因素試驗結果Tab．3 Results of single factor tests for extraction frequency

2.5 正交試驗 按本品處方比例，稱取蒼術、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜共75.4 g，在單因素試驗基礎上，以提取次數（A）、加水量（B）、提取時間（C） 為影響因素，梔子苷、落新婦苷、水浸出物含量為評價指標，權重系數分別設定為0.4、0.4、0.2，采用L9（34） 正交表進行設計，因素水平見表4。

表4 因素水平Tab．4 Factors and levels

按本品處方比例，稱取蒼術、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜適量，以表4 因素水平進行提取，濾過，合并提取液，置于2 000 mL 量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，取續濾液，測定落新婦苷、梔子苷、水浸出物含量，結果見表5。

表5 試驗設計與結果Tab．5 Design and results of tests

對表5 數據進行方差分析，結果見表6。由此可知，各因素影響程度依次為提取時間＞提取次數＞加水量；提取時間對提取效果有顯著影響（P＜0.05），而提取次數、加水量無顯著影響（P＞0.05）。為了降低成本、節省工時，并結合單因素試驗結果，最終確定最優工藝為A2B2C2，即提取時間1.0 h，加水量10 倍，提取次數2 次。

表6 方差分析Tab．6 Analysis of variance

再按上述優化工藝進行3 批驗證試驗，結果見表7。由此可知，該工藝穩定可行。

表7 驗證試驗結果（n＝3）Tab．7 Results of verification tests （n＝3）

3 質量標準研究

3.1 定性鑒別 采用TLC 法。

3.1.1 梔子、葛根

3.1.1.1 供試品溶液制備 將本品內容物研細，取約3 g，置于具塞錐形瓶中，30 mL 甲醇超聲提取45 min，濾過，水浴蒸干濾液，20 mL 水溶解殘渣，稀鹽酸調pH 至約為2，20 mL 乙醚振搖提取2次，除去乙醚液，水液加20 mL 二氯甲烷振搖提取2 次，除去二氯甲烷液，水液加20 mL 乙酸乙酯振搖提取2 次，合并水液，調pH 至中性，20 mL 乙酸乙酯提取2 次，水液再用水飽和正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，1 mL甲醇溶解殘渣，即得。

3.1.1.2 對照品溶液制備 取梔子苷、葛根素對照品適量，甲醇制成質量濃度為1 mg／mL 的溶液，即得。

3.1.1.3 陰性樣品溶液制備 根據本品處方比例，制成缺梔子、缺葛根的陰性樣品，按“3.1.1.1”項下方法制備，即得。

3.1.1.4 鑒別方法 對照品、供試品、陰性樣品溶液在硅膠G 薄層板上各點樣6 μL，以三氯甲烷-甲醇-水（14 ∶5 ∶0.5） 為展開劑，在365 nm 紫外燈下檢視，或噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風加熱至斑點清晰，結果見圖3。由此可知，供試品在對照品同一位置處均顯示相同斑點，陰性無干擾。

圖3 葛根、梔子TLC 色譜圖Fig．3 TLC chromatograms of Puerariae lobatae Radix and Gardeniae Fructus

3.1.2 丹參、大黃

3.1.2.1 供試品溶液制備 將本品內容物研細，取約3 g，置于具塞錐形瓶中，40 mL 甲醇溶解，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴蒸干，20 mL 水溶解殘渣，25 mL 乙醚提取，除去乙醚液，水液用鹽酸調pH 至約為2～3，25 mL 乙醚提取，除去乙醚液，水液用25 mL 乙酸乙酯提取2 次，合并乙酸乙酯液，30 mL 水洗滌，棄去水液，水浴蒸干，1 mL甲醇溶解殘渣，即得。

3.1.2.2 對照藥材溶液制備 取丹參對照藥材0.5 g，20 mL 鹽酸回流提取45 min，濾過，25 mL乙酸乙酯振搖提取2 次，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，1 mL 甲醇溶解殘渣，即得相應溶液。再取大黃對照藥材0.5 g，20 mL 甲醇溶解，超聲提取30 min，取5 mL 濾液，水浴蒸干，20 mL 水+1 mL 鹽酸溶解殘渣，加熱回流提取30 min，冷卻至室溫，20 mL 乙醚提取2 次，合并提取液，水浴蒸干，2 mL 三氯甲烷溶解殘渣，即得相應溶液。

3.1.2.3 陰性樣品溶液制備 根據本品處方比例，制成缺丹參、缺大黃的陰性樣品，按“3.1.2.1”項下方法制備，即得。

3.1.2.4 鑒別方法 供試品、對照藥材、陰性樣品溶液在硅膠G 薄層板上各點樣3～5 μL，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8 ∶5 ∶3） 為展開劑，置于氨蒸氣中放置15 min，在365 nm 紫外燈下檢視，結果見圖4。由此可知，供試品在對照藥材同一位置處顯示相同斑點，陰性無干擾。

圖4 大黃、丹參TLC 色譜圖Fig．4 TLC chromatogram of Rhei Radix et Rhizoma and Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizoma

3.2 含量測定 采用HPLC 法。

3.2.1 色譜條件 Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.1%磷酸，梯度洗脫，程序［15］見表8；體積流量0.8 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長294 nm；進樣量10 μL。

表8 梯度洗脫程序Tab．8 Gradient elution programs

3.2.2 對照品溶液制備 取綠原酸、葛根素、大豆苷、毛蕊花糖苷、落新婦苷、丹酚酸B、大豆苷元對照品適量，置于5 mL 棕色量瓶中，甲醇超聲溶解定容，搖勻，即得（各成分質量濃度分別為0.331、2.392、0.770、1.084、0.208、1.322、0.148 mg／mL）。

3.2.3 供試品溶液制備 將本品內容物研細，取約1 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，20 mL 75%甲醇溶解，稱定質量，超聲（250 W、40 kHz） 提取45 min，冷卻至室溫，75% 甲醇補足減失的質量，濾過，取續濾液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

3.2.4 陰性樣品溶液制備 根據本品處方比例，制成缺茵陳、葛根、土茯苓、車前子、丹參的陰性樣品，按“3.2.3” 項下方法制備，即得。

3.2.5 方法學考察

3.2.5.1 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“3.2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖5。由此可知，各成分色譜峰均可明顯分離（分離度＞1.5），理論塔板數均符合2020年版《中國藥典》 單味藥材含量測定標準，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖5 各成分HPLC 色譜圖Fig．5 HPLC chromatograms of various constituents

3.2.5.2 線性關系考察 精密吸取“3.2.2” 項下對照品溶液100、250、500、750、1 000 μL，置于5 mL 棕色量瓶中，75%甲醇定容，得系列質量濃度，在“3.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標 （X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，并分別以信噪比3 ∶1、10 ∶1 為檢測下限、定量下限，結果見表9，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表9 各成分線性關系Tab．9 Linear relationships of various constituents

3.2.5.3 精密度試驗 取同一份對照品溶液，在“3.1.2” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得綠原酸、葛根素、大豆苷、毛蕊花糖苷、落新婦苷、丹酚酸B、大豆苷元峰面積RSD 分別為0.51%、1.70%、0.07%、0.50%、0.57%、0.73%、0.55%，表明儀器精密度良好。

3.2.5.4 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12 h 在“3.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得綠原酸、葛根素、大豆苷、毛蕊花糖苷、落新婦苷、丹酚酸B、大豆苷元峰面積RSD 分別為1.45%、1.15%、1.14%、1.77%、1.82%、1.53%、0.80%，表明溶液在12 h 內穩定性良好。

3.2.5.5 重復性試驗 取同一批本品，按“3.2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“3.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得綠原酸、葛根素、大豆苷、毛蕊花糖苷、落新婦苷、丹酚酸B、大豆苷元峰面積RSD 分別為1.44%、1.73%、2.00%、2.03%、1.72%、1.75%、1.01%，表明該方法重復性良好。

3.2.5.6 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的本品粉末6 份，加入對照品適量，按“3.2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“3.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，綠原酸、葛根素、大豆苷、毛蕊花糖苷、落新婦苷、丹酚酸B、大豆苷元平均加樣回收率分別為98.0%、96.9%、97.7%、100.5%、99.3%、99.5%、98.4%，RSD分別為1.52%、1.21%、0.82%、2.62%、1.17%、1.76%、1.49%。

3.2.5.7 樣品含量測定 取3 批中試樣品（批號20201101、20201202、20210103），每批3 份，按“3.2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“3.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表10。

表10 各成分含量測定結果Tab．10 Results of content determination of various constituents

4 討論

4.1 評價指標選擇 君藥蒼術指標成分蒼術素為揮發性化合物，難溶于水，含量較低，故選擇臣藥梔子、土茯苓中的主要成分。2020 年版《中國藥典》 一部規定，梔子中梔子苷含量不得低于1.8%，土茯苓中落新婦苷含量不得低于0.45%，兩者不僅是主要降糖活性成分，而且含量較高，易溶于水，化學性質穩定，測定方法成熟，同時水浸出物含量能側面反應蒼術等8 味藥材提取率。結合文獻［16-18］，本實驗以梔子苷、落新婦苷、水浸出物含量為評價指標。

4.2 TLC 鑒別方法和藥材選擇 本實驗鑒別梔子、葛根時，參照2020 年版《中國藥典》 中牛黃凈腦片制劑項下方法；鑒別大黃、丹參時，以對照藥材定性，供試品溶液中與大黃對應的點為大黃酚，而與丹參對應的點尚不明確，有待進一步探索。同時，梔子、葛根選擇同一處理方法、展開系統及不同顯色方法進行鑒別，而大黃、丹參選擇同一處理方法、展開條件、顯色方法進行鑒別，既可簡化操作步驟，又能節能減排。另外，白術、茯苓、車前子、木瓜、茵陳均有陰性干擾，經檢測方法篩選、展開系統調整后仍無法排除；厚樸雖然無陰性干擾，但目標斑點模糊，不易辨認，故本實驗未對上述6 味藥材進行鑒別。

4.3 含量測定指標選擇 預實驗發現，君藥蒼術指標成分蒼術素易揮發，在提取、樣品處理過程中含量太低而檢測不到；白術內酯類成分是白術發揮降糖作用的有效成分，但其化學性質不穩定［19-21］，容易發生轉化，并且對照品價格較高。因此，本實驗選擇臣藥及其他藥材有效成分進行測定。

4.4 流動相選擇 本實驗參考文獻［22-24］ 并經反復摸索，確定甲醇-0.1%磷酸作為流動相，并且采用梯度洗脫，此時各成分分離度均大于1.5，理論塔板數均符合要求。

4.5 檢測波長選擇 各成分吸收波長分布在238、250、327 nm 處，其中238 nm 處吸收峰峰值較高，但出峰數量較少；327 nm 處色譜峰峰值較低；250 nm 處色譜峰數量較少。經反復摸索，最終選擇294 nm 作為中間值，在保證色譜峰數量的同時峰值也不會太低。

5 結論

本實驗所建立的消渴健脾膠囊制備工藝符合要求，可投入生產，并且其質量標準合理可靠，可為后續相關研究提供一定參考。