HPLC-DAD 法同時測定當歸祛風合劑中6 種成分

謝 寒，明 荷，方應權(quán)，祝守敏

（1.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學校附屬醫(yī)院，重慶 404000；2.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學校，重慶 404120）

當歸祛風合劑是重慶三峽醫(yī)藥高等專科學校附屬醫(yī)院楊炳川主任藥師研發(fā)的中藥制劑，由當歸、生地、白芍、白鮮皮、黃芪、防風、甘草等藥材組成，結(jié)合局部的細火針用于治療血虛風燥型神經(jīng)性皮炎，多年臨床實踐表明其療效確切。方中當歸、生地為君藥，調(diào)養(yǎng)營血、滋陰生津以治本［1-2］，其中前者有效成分阿魏酸具有抗炎、補血活血等功效［3-4］，而后者活性成分毛蕊花糖苷具有抗氧化、提高免疫力作用，可降低神經(jīng)性皮炎小鼠模型中的整體搔抓行為、新皮疹發(fā)生率［5-6］；白芍、白鮮皮、黃芪為臣藥，功效清熱燥濕、祛風解毒、益氣固表［7-10］，其中白芍是治療血虛風燥證神經(jīng)性皮炎的常用中藥［7-8］，芍藥苷是其主要有效成分，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用［11-12］，白鮮皮所含白鮮堿具有收縮血管平滑肌、抗炎、抗氧化作用［13-14］；防風、甘草為佐使藥，調(diào)和諸藥，使全方共奏活血、止痛、止痙功效［15-16］，并且前者所含升麻素苷、后者所含甘草苷均具有抗炎作用［16-17］。

目前，尚未開展對當歸祛風合劑質(zhì)量控制的系統(tǒng)研究，也未對其進行有效成分含量測定。因此，本實驗采用HPLC-DAD 法同時測定阿魏酸、毛蕊花糖苷、芍藥苷、白鮮堿、升麻素苷、甘草苷的含量，以期為該制劑進一步開發(fā)利用、質(zhì)量控制、臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜系統(tǒng)，配置G1315B 二極管陣列檢測器（美國Agilent 公司）；艾本德5430R 離心機 （德國艾本德公司）；BP211D 電子天平（德國賽多利斯公司）；D1810C純凈水蒸餾器 （上海申生科技有限公司）；KQ-300DE 型醫(yī)用超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 阿魏酸（批號121007-211506，純度99.4%）、毛蕊花糖苷（批號111621-211817，純度95.2%）、升麻素苷 （批號111522-200406，純度96.5%）、甘草苷（批號111609-211907，純度95.0%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；芍藥苷對照品 （批號23180-61-8，純度≥98.5%） 購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；白鮮堿對照品（批號MUST-21082203，純度≥98%） 購自成都曼思特生物科技有限公司。當歸、生地、白芍、白鮮皮、防風、甘草、黃芪均購自重慶中藥材有限公司，經(jīng)三峽中藥研究所付紹智教授鑒定為正品，均符合2020 年《中國藥典》 規(guī)定。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為重蒸水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Ultimate C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相0.1% 磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～35 min，20%～42%B；35～40 min，42%～85%B；40～60 min，85% B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長280 nm （阿魏酸）、334 nm （毛蕊花糖苷）、230 nm （芍藥苷）、236 nm （白鮮堿、甘草苷）、240 nm （升麻素苷）；進樣量20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，作為貯備液，分別精密吸取適量，置于同一25 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為白鮮堿 8.89 μg／mL、甘草苷 230.84 μg／mL、芍藥苷604.82 μg／mL、升麻素苷75.24 μg／mL、阿魏酸36.17 μg／mL、毛蕊花糖苷25.12 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 精密量取本品1 mL，置于50 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，超聲（500 W、50 Hz） 處理30 min，靜置至室溫，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按本品處方比例，分別制成缺白鮮皮（白鮮堿）、缺甘草（甘草苷）、缺白芍（芍藥苷）、缺防風（升麻素苷）、缺當歸（阿魏酸）、缺生地（毛蕊花糖苷） 的陰性樣品，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰分離情況良好（分離度＞1.6），理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計，均大于2 700，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig．1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1” 項下對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，制成系列質(zhì)量濃度，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質(zhì)量濃度（X） 進行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab．1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 精密吸取同一份對照品溶液20 μL （含白鮮堿 0.89 μg／mL、甘草苷 23.08μg／mL、芍藥苷60.48 μg／mL、升麻素苷7.52 μg／mL、阿魏酸3.62 μg／mL、毛蕊花糖苷2.51 μg／mL），在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得測得白鮮堿、甘草苷、芍藥苷、升麻素苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面積RSD 分別為2.12%、1.86%、2.51%、1.17%、3.06%、3.87%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份本品 （批號20211012），按“2.2.2 ” 項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得白鮮堿、甘草苷、芍藥苷、升麻素苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面積RSD分別為3.12%、2.56%、2.26%、2.73%、3.61、4.08%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗 取同一份本品 （批號20211012），按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得白鮮堿、甘草苷、芍藥苷、升麻素苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面積RSD 分別為3.20%、1.71%、2.29%、2.85%、3.76%、3.82%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密吸取本品 （批號20211012） 0.5 mL，加入“2.2.1” 項下對照品溶液2.5 mL，按“2.2.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，白鮮堿、甘草苷、芍藥苷、升麻素苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷平均加樣回收率分別為101.15%、100.50%、97.41%、95.56%、105.29%、98.93%，RSD 分別為3.92%、2.77%、3.83%、2.80%、3.64%、3.64%。

2.9 樣品含量測定 取3 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定3 次，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果（μg／mL，n＝3）Tab．2 Results of content determination of various constituents （μg／mL，n＝3）

3 討論

3.1 檢測指標選擇 本實驗根據(jù)相關(guān)文獻報道、前期預實驗結(jié)合HPLC-DAD 儀器特點，選擇各藥材中既有藥理活性，含量又較高的白鮮堿、甘草苷、芍藥苷、升麻素苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷進行含量測定。另外，黃芪常以黃芪甲苷為指標［18］，采用蒸發(fā)光散射檢測器進行測定［19］，但無法與本實驗方法統(tǒng)一，故未納入該成分。

3.2 色譜條件選擇 本實驗所測6 種成分的紫外吸收差異較大，故采用DAD 檢測器在190～400 nm波長處掃描以確定最大吸收波長，并選擇多波長切換模式，使其均有較大的吸收值，并使測定方法更靈敏、準確、實用。然后，在相關(guān)文獻報道、前期預實驗基礎上，本實驗分別考察了以一定體積分數(shù)甲酸、磷酸、磷酸鹽緩沖液、三氟乙酸溶液為水相，甲醇或乙腈為有機相的流動相，最終確定為0.1%磷酸-乙腈梯度洗脫，此時分析時間短，各成分分離度、理論塔板數(shù)符合要求。

4 結(jié)論

本實驗建立HPLC-DAD 法同時測定當歸祛風合劑中白鮮堿、甘草苷、芍藥苷、升麻素苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷含量，該方法簡便、準確、可靠，可為該制劑質(zhì)量控制、臨床應用提供參考。