基于網絡藥理學探討化濁行血湯抗高脂血癥的作用機制*

席加秋，邵玉澤，王中琳，2

（1.山東中醫藥大學，濟南 250355；2.山東中醫藥大學附屬醫院，濟南 250355）

高脂血癥以總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高，和/或高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低為特征[1]。高脂血癥能夠引發復雜的血管病變。在經過血管內皮損傷、脂質沉積、平滑肌細胞增生等病理環節后，血管壁逐漸增厚、狹窄，失去其應有彈性，引發高血壓、冠心病、心肌梗死、腦梗死等多種心腦血管疾病。心腦血管疾病造成了沉重的社會經濟負擔，成為人類主要死亡原因之一[2-3]。因此，對高脂血癥進行有效干預是防治心腦血管疾病的重要舉措。目前，他汀類藥物被推薦為一線降脂藥[4]。但不容忽視的是，越來越多的證據表明，他汀藥物在降脂的同時能夠引發肌痛、橫紋肌溶解、肝腎毒性等嚴重不良反應[5-6]。鑒于目前治療方法的局限性，尋找天然、有效的補充或替代策略逐漸成為治療高脂血癥的關注重點。

王新陸教授在《腦血辨證》一書中首次提出了“血濁”的概念。血濁指血液受各種因素影響，失去其清純狀態，或喪失其循行規律，影響臟腑氣機的病理現象，與高脂血癥的特點相契合[7-8]。王新陸教授認為，運氣不同，古今異軌，現代疾病譜的構成已由過去感染、營養不良等單因素疾病為主轉變為以機體自身代謝和調控失常導致的慢性非傳染性疾病為主。后者也被稱為“現代生活方式病”，由精神壓力增加，過食肥甘厚味，勞逸失度等因素誘發，與當今物質文明飛速發展息息相關。“血濁”正是在這一新的時代背景下應運而生的概念。對血濁狀態的干預能夠將心腦血管疾病的治療方向前移到“治未病”層面，若及渴而穿井，斗而鑄錐，則治療難度增大，且易出現后遺癥狀。因此，在血濁學術理論的指導下，王新陸教授創制了治療高脂血癥的化濁行血湯。化濁行血湯由荷葉、焦山楂、決明子、赤芍、酒大黃、路路通、虎杖、何首烏、水蛭粉9 味中藥組成。方中荷葉、決明子、焦山楂功善清化濁邪而無耗血傷陰之弊，共為君藥。水蛭粉、酒大黃、赤芍通行血脈，善消堅積，助君藥清化血濁，共為臣藥。路路通利水除濁，兼通經活絡，虎杖活血化濁，兼清血濁內郁之熱，何首烏消脂通便，兼補濁邪內耗之陰血，共為佐藥。諸藥合用，共奏化濁消脂，行血暢血之功。前期臨床研究已證明，化濁行血湯能夠有效降低高脂血癥患者的血脂水平，且未出現明顯的毒副作用[9]。目前，化濁行血湯抗高脂血癥的作用機制尚未闡明，故本研究擬借助網絡藥理學方法對其潛在機制進行科學預測，并對預測結果進行實驗驗證，以期為深入探究化濁行血湯抗高脂血癥的作用機制提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠60 只，6 周齡，體質量（180±20）g，購于濟南朋悅實驗動物有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（魯）20190003。SD 大鼠飼養于山東中醫藥大學附屬醫院動物實驗中心，室內保持12 h 晝夜節律，溫度（25±2）℃，自由攝食飲水。本研究通過山東中醫藥大學附屬醫院倫理委員會審批，審查編號：AWE-2019-042。

1.2 藥物及試劑 化濁行血湯：荷葉15 g，焦山楂10 g，決明子15 g，赤芍10 g，酒大黃10 g，路路通10 g，虎杖10 g，何首烏10 g，水蛭粉3 g，以上藥物浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮20 min 后取濾液，加水繼煮15 min 后再取濾液，兩次濾液合并，濃縮成質量濃度為4 g/mL 的化濁行血湯水煎液，存于4 ℃冰箱備用（山東省中醫院藥劑科），辛伐他汀片20 mg/片（杭州默沙東制藥有限公司），高脂飼料：豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇1%，膽酸鹽0.2%，基礎飼料78.8%（山東百朋生物科技有限公司），TG、TC、LDL-C、HDL-C 試劑盒（山東賽恩斯生物科技有限公司），蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（山東思科捷生物技術有限公司），TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa，No.9767），Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR Ⅱ（ACCURATE，No.AG11711），SYBR Green Premix Pro TaqHS qPCR Kit（ACCURATE，No.AG11701）。

1.3 實驗儀器 輪轉式切片機（Leica，德國），熒光倒置顯微鏡（Leica，德國），PRONTO EVOLUTION 全自動生化分析儀（BPC Bio Sed，意大利），Nano Drop 2000 分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國），Light Cycler 480ⅡReal-time PCR 儀（Roche，瑞士）。

1.4 動物分組與給藥 適應性喂養1 周后，按體質量隨機分為對照組、模型組、化濁行血湯高劑量組、化濁行血湯中劑量組、化濁行血湯低劑量組、辛伐他汀組，每組10 只。對照組予普通飼料喂養，其余組給予高脂飼料喂養。8 周后目內眥靜脈叢取血，測得受試動物血中TC、TG、LDL-C 顯著升高，確定高脂血癥模型復制成功。根據《藥理實驗方法學》中的不同種類受試對象劑量換算方法，查詢人與大鼠間劑量換算系數及校正系數，計算得出180 g 大鼠每日用藥劑量是標準體質量成人每日用藥劑量的5.8 倍[10]，故化濁行血湯高、中、低劑量組每日給藥劑量分別為18、9、4.5 g/kg，辛伐他汀組每日給藥劑量為4 mg/kg，對照組和模型組予等體積生理鹽水5 mL/kg。連續灌胃8 周，每日1 次。

1.5 體質量、肝濕質量、肝指數測定 每兩周測定1 次大鼠體質量。末次給藥后，禁食不禁水12 h，予40 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。腹主動脈取血8 mL，并在冰上迅速分離肝組織，使用預冷磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗，濾紙吸取多余水分，稱取肝臟濕質量。稱量完畢后分裝速凍，存于-80 ℃冰箱備用。肝指數=肝濕質量/體質量×100%。

1.6 HE 染色 取部分分離的肝組織于4%多聚甲醛中固定，脫水包埋后將組織切片，厚度為5 μm，對切片進行脫蠟水化處理，進行HE 染色，脫水封片，光鏡下觀察肝臟的組織學變化。

1.7 血清生化指標檢測 采用全自動生化分析儀，嚴格按試劑盒說明檢測血清TC、TG、LDL-C 和HDL-C 含量。

1.8 化濁行血湯成分篩選及靶點預測 應用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）及中藥分子機制生物信息分析工具數據庫（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm）預測荷葉、山楂、決明子、赤芍、大黃、水蛭、路路通、虎杖、何首烏九味藥物的化學成分及潛在靶點。TCMSP 數據庫篩選條件設置為口服生物利用度OB ≥30% ，且類藥性DL ≥0.18；BATMAN-TCM 數據庫篩選條件設置為截斷值≥20，P<0.05。應用通用蛋白質資源庫（UniProt，https：//www.uniprot.org）對靶點蛋白名進行規范化處理。

1.9 高脂血癥靶點預測 以“高脂血癥”為檢索詞，應用藥物銀行（Drugbank，https：//www.drugbank.ca）、疾病相關基因與突變位點數據庫（DisGeNET，https：//www.disgenet.org）、比較毒理基因組數據庫（CTD，http：//ctdbase.org）、人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https：//omim.org）及遺傳關聯數據庫（GAD，https：//geneticassociationdb.nih.gov）查找高脂血癥相關靶點。應用UniProt 數據庫對靶點蛋白名進行規范化處理。

1.10 化濁行血湯抗高脂血癥的成分-靶點網絡及蛋白互作（PPI）網絡構建 首先，借助TBtools v0.5確定化濁行血湯與高脂血癥的交集靶點，交集靶點即為化濁行血湯抗高脂血癥的潛在靶點。查找交集靶點所對應化濁行血湯的活性成分，構建化濁行血湯抗高脂血癥的成分-靶點網絡。將交集靶點導入STRING 數據庫（https：//string-db.org/）構建PPI 網絡，并借助Cytoscape3.7.2 插件cytoHubba 拓撲化濁行血湯抗高脂血癥的關鍵靶點。

1.11 基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 將化濁行血湯抗高脂血癥的交集靶點導入基因注釋形象集成數據庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov），設置背景基因為“Homo sapiens”，P<0.05。利用R 語言工具包繪制生物過程、細胞組分、分子功能條形圖及通路高級氣泡圖。

1.12 RT-PCR 檢測 對肝組織樣本使用液氮研磨，使用Buffer RL 進行裂解，按說明書要求提取總RNA，測定總RNA 濃度及完整性。將總RNA 按說明書要求，使用M-MLV RTase Enzyme MIX 逆轉錄為cDNA。將cDNA 按說明書要求，使用2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 進行PCR 擴增。反應條件：預變性95 ℃30 s（1 個循環）；定量分析95 ℃5 s，60 ℃30 s（40 個循環）；溶解曲線采集95 ℃5 s，60 ℃60 s，95 ℃酶瞬間滅活（1 個循環）；冷卻40 ℃30 s（1 個循環）。以GAPDH 為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。引物由山東賽恩斯生物科技有限公司設計合成，引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 Primer sequence used for RT-PCR analysis

1.13 統計學方法 應用SPSS 23.0 進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 化濁行血湯對高脂血癥大鼠體質量、肝濕質量、肝指數的影響 各組大鼠間體質量差異無統計學意義（P>0.05）。與對照組比較，模型組大鼠肝濕質量和肝指數升高（P<0.01）。與模型組比較，辛伐他汀與化濁行血湯各劑量組均能降低高脂血癥大鼠肝濕質量和肝指數（P<0.05 或P<0.01）。見表2。

表2 化濁行血湯對高脂血癥大鼠體質量、肝濕質量、肝指數的影響（±s）Tab.2 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on weight，hepatic wet weight，and liver index in hyperlipidemia rats（±s）

表2 化濁行血湯對高脂血癥大鼠體質量、肝濕質量、肝指數的影響（±s）Tab.2 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on weight，hepatic wet weight，and liver index in hyperlipidemia rats（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

肝指數（%）對照組10-471.20±61.11 10.18±1.312.09±0.17模型組10-526.40±32.54 14.07±1.50** 2.67±0.15**辛伐他汀組102×10-3 479.70±66.95 10.88±1.15▲▲ 2.29±0.24▲▲化濁行血湯組1018.0 458.70±34.45 10.64±1.42▲▲ 2.32±0.25▲▲109.0 476.20±36.21 11.22±1.38▲▲ 2.35±0.15▲104.5 492.10±66.75 11.47±0.54▲▲ 2.36±0.29▲組別動物數劑量（g/kg）體質量（g）肝濕質量（g）

2.2 化濁行血湯對高脂血癥大鼠血脂水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠TC，TG 及LDL-C水平升高（P<0.01），HDL-C 水平差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，辛伐他汀與化濁行血湯各劑量組均能降低高脂血癥大鼠TC，TG 及LDL-C 水平，高中劑量化濁行血湯能夠升高大鼠HDL-C 水平（P<0.05 或P<0.01）。以上結果表明高中劑量化濁行血湯的降脂作用與辛伐他汀療效相當（表3）。

表3 化濁行血湯對高脂血癥大鼠血脂水平的影響（±s）Tab.3 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on lipid levels in hyperlipidemia rats（±s）

表3 化濁行血湯對高脂血癥大鼠血脂水平的影響（±s）Tab.3 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on lipid levels in hyperlipidemia rats（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與辛伐他汀組比較，##P<0.01。

組別動物數劑量（g/kg）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）對照組10-0.97±0.070.53±0.160.33±0.030.97±0.18模型組10-1.61±0.03**1.94±0.16**0.67±0.03**0.85±0.11辛伐他汀組102×10-31.10±0.09▲▲0.89±0.15▲▲0.43±0.04▲▲0.80±0.09化濁行血湯組1018.01.16±0.06▲▲0.86±0.08▲▲0.51±0.05▲▲1.21±0.03▲▲##109.01.24±0.05▲1.00±0.20▲▲0.49±0.08▲▲1.12±0.03▲##104.51.38±0.07▲##1.20±0.07▲▲0.53±0.07▲1.02±0.08

2.3 化濁行血湯對高脂血癥大鼠肝臟病理形態學的影響 HE 染色結果顯示，與對照組相比，模型組大鼠肝小葉結構紊亂，肝竇缺失，肝細胞腫脹變性，內部可見脂肪滴沉積，部分細胞核因脂滴擠壓而發生偏位。與模型組相比，化濁行血湯各劑量組和辛伐他汀組肝臟組織結構排列較整齊，脂肪變性明顯減輕（圖1）。

圖1 化濁行血湯對高脂血癥大鼠肝臟病理形態學的影響（HE，×400）Fig.1 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on pathological and morphological changes of liver in hyperlipidemia rats（HE，×400）

2.4 化濁行血湯成分篩選及靶點預測 化濁行血湯各中藥符合TCMSP 數據庫及BATMAN-TCM 數據庫篩選條件的化學成分及相關靶點數目如下：山楂2 個化學成分涉及25 個作用靶點，荷葉15 個化學成分涉及430 個作用靶點，決明子14 個化學成分涉及231 個作用靶點，赤芍29 個化學成分涉及218 個作用靶點，大黃16 個化學成分涉及183 個作用靶點，水蛭1 個化學成分涉及171 個作用靶點，虎杖10 個化學成分涉及294 個作用靶點，路路通4 個化學成分涉及110 個作用靶點，何首烏1 個化學成分涉及14 個作用靶點。經去重處理后，化濁行血湯全方共涉及56 種化學成分，327 個作用靶點。

2.5 高脂血癥靶點預測 在各疾病數據庫分別檢索得到高脂血癥靶點數目如下：Drugbank29 個、DisGeNET19 個、CTD33 個、OMIM50 個、GAD72 個。經去重處理后，共獲取148 個高脂血癥作用靶點。

2.6 化濁行血湯抗高脂血癥的成分-靶點網絡構建 構建韋恩圖獲取化濁行血湯與高脂血癥的交集靶點37 個（見OSID 標識碼），交集靶點即為化濁行血湯抗高脂血癥的潛在治療靶點。37 個交集靶點涉及化濁行血湯37 種生物活性成分。應用Cytoscape3.7.2 構建化濁行血湯抗高脂血癥的成分-靶點網絡（見OSID 標識碼）。對該網絡進行拓撲屬性分析，菱形節點代表中藥成分，degree 值越大，菱形節點越大。根據degree 值可知quercetin（槲皮素）的潛在靶點最多，其次為Crocetin（藏花酸）、kaempferol（山柰酚）、Stigmastero（l豆甾醇）、Physovenine（毒扁豆次堿）等（表4）。說明上述化學成分為化濁行血湯抗高脂血癥的關鍵成分。

表4 化濁行血湯抗高脂血癥的活性成分（degree 值排名前10）Tab.4 Active compounds of Huazhuo Xingxue Decoction in the treatment of hyperlipidemia（top 10 of degree value）

2.7 化濁行血湯抗高脂血癥的PPI 網絡構建 將37 個交集靶點導入STRING 數據庫構建交集靶點的PPI 網絡（圖2），該網絡包括36 個節點和157 條邊。借助Cytoscape3.7.2 插件cytoHubba 獲取排名前15 的關鍵靶點，并構建關鍵靶點的PPI 網絡，該網絡包括15 個節點和77 條邊（圖2）。15 個關鍵靶點如下：胰島素（INS）、三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白A1（ABCA1）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管細胞黏附因子1（VCAM1）、內皮型一氧化氮合酶（NOS3）、氧磷酶1（PON1）、三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G1（ABCG1）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ （PPARG）、脂聯素（ADIPOQ）、肝X 受體α（NR1H3）、微粒體甘油三酸酯轉運蛋白（MTTP）、乙酰輔酶A 羧化酶（ACACA）、E 選擇素（SELE）、載脂蛋白A2（APOA2）。

圖2 化濁行血湯抗高脂血癥靶點蛋白的PPI 網絡Fig.2 PPI network of Huazhuo Xingxue Decoction in the treatment of hyperlipidemia

2.8 GO 與KEGG 富集分析 將37 個交集靶點導入David 數據庫進行GO 與KEGG 富集分析，結果表明化濁行血湯抗高脂血癥涉及152 個生物過程、23 個細胞組分、33 種分子功能、22 條作用通路。對P 值排名前10 的GO 條目及全部KEGG 通路進行可視化處理（圖3、圖4）。其中，排名前3 的生物過程：GO：0010745 negative regulation of macrophage derived foam cell differentiation（對巨噬細胞來源的泡沫細胞分化的負調控）、GO：0010887 negative regulation of cholesterol storage（對膽固醇儲存的負調控）、GO：0010875 positive regulation of cholesterol efflux（對膽固醇外流的正調控）；細胞組分：GO：0043235 receptor complex（受體復合物）、GO：0045121 membrane raft（膜筏）、GO：0034366 spherical high-density lipoprotein particle（球形高密度脂蛋白顆粒）；分子功能：GO：0004879 RNA polymerase Ⅱtranscription factor activity，ligand -activated sequence -specific DNA binding（RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA 結合）、GO：0003707 steroid hormone receptor activity（類固醇激素受體活性）、GO：0008131 primary amine oxidase activity（初級胺氧化酶活性）；作用通路為：hsa03320：PPAR signaling pathway（PPAR 信號通路）、hsa04931：Insulin resistance（胰島素抵抗）、hsa04932：Non-alcoholic fatty liver disease（非酒精性脂肪肝）。

圖3 化濁行血湯抗高脂血癥的GO 功能富集分析Fig.3 GO functional annotation enrichment analyses of Huazhuo Xingxue Decoction in the treatment of hyperlipidemia

圖4 化濁行血湯抗高脂血癥的KEGG 通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analyses of Huazhuo Xingxue Decoction in the treatment of hyperlipidemia

2.9 化濁行血湯對高脂血癥大鼠AdipoR2、PPARα、APOA2 mRNA 表達的影響 根據富集分析結果，PPAR 信號通路是富集程度最高的通路，ADIPOQ、APOA2、PPARα、PPARγ、NR1H3、PPARD、RXRA 是富集在該通路上的信號分子，其中ADIPOQ、APOA2、PPARα、PPARγ、NR1H3 是“2.4 化濁行血湯抗高脂血癥的PPI 網絡構建”中鑒定出的關鍵靶點，因此，初步篩選出以上5 個靶點為后續的研究指標。通過查閱相關文獻，ADIPOQ 發揮其生物學作用主要是通過與其受體結合而實現[11]，而AdipoR2 是肝臟中ADIPOQ 的主要受體[12]。研究證實，AdipoR2 為PPARα 上游信號分子，APOA2為PPARα 下游信號分子[12-13]，故本研究最終選取AdipoR2、PPARα、APOA2 進行實驗驗證。與對照組比較，模型組大鼠AdipoR2、PPARα mRNA 表達下調（P<0.05 或P<0.01），APOA2 mRNA 與對照組間的表達差異無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，化濁行血湯高劑量組及辛伐他汀組AdipoR2 mRNA表達上調（P<0.05 或P<0.01），化濁行血湯高中劑量組及辛伐他汀組PPARα mRNA 表達上調（P<0.01），化濁行血湯高中劑量組APOA2 mRNA 表達下調（P<0.01），見表5。表明化濁行血湯改善脂代謝紊亂，減輕脂質沉積的作用機制可能與干預AdipoR2/PPARα/APOA2 信號通路相關。

表5 化濁行血湯對高脂血癥大鼠AdipoR2，PPARα，APOA2 mRNA 水平的影響（±s）Tab.5 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on the expression of AdipoR2，PPARα，APOA2 mRNA in hyperlipidemia rats（±s）

表5 化濁行血湯對高脂血癥大鼠AdipoR2，PPARα，APOA2 mRNA 水平的影響（±s）Tab.5 Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on the expression of AdipoR2，PPARα，APOA2 mRNA in hyperlipidemia rats（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別動物數劑量（g/kg）AdipoR2PPARαAPOA2對照組10- 1.011±0.176 1.001±0.049 1.001±0.063模型組10- 0.677±0.078* 0.395±0.004** 0.788±0.161辛伐他汀組102×10-3 1.003±0.099▲ 1.537±0.038▲▲0.586±0.065化濁行血湯組1018.0 1.246±0.044▲▲1.523±0.037▲▲0.226±0.024▲▲109.0 0.636±0.028 1.073±0.064▲▲0.417±0.022▲▲104.5 0.457±0.013 0.449±0.007 0.610±0.057

3 討論

化濁行血湯是王新陸教授診病疏方五十余載，基于血濁學術理論創制的治療高脂血癥的經驗方。方中荷葉清香升散，利濕化濁；決明子“利五臟，除肝家熱”，通便祛濁；山楂入血分，善消肉食油膩之積，消積去濁，三藥合用，化濁邪，行血脈，共為君藥。赤芍清熱涼血，活血化瘀；大黃善入血分，泄下攻積；水蛭“性遲緩善入，遲緩則生血不傷，善入則堅積易破”，三藥寓“見血之濁，知血當滯，當先行血”之意，通行血脈助君化濁，共為臣藥。虎杖清熱利濕化濁，尤善血濁郁而生熱者；路路通“通行十二經穴”，引君臣藥直達病所；何首烏補肝腎、益精血，防瀉濁之品耗傷營陰，3 味藥共為佐藥。9 味藥相伍，共奏化濁行血之功。

本研究借助網絡藥理學方法，篩選得到槲皮素、藏花酸、山柰酚、豆甾醇等是化濁行血湯抗高脂血癥的關鍵活性成分。作為一種天然的黃酮類化合物，槲皮素具有確切的降脂作用[14]。研究表明，槲皮素能夠通過上調乙酰輔酶A 氧化酶（ACO）、乙酰輔酶A 酰基轉移酶（ACAT）等脂肪酸氧化相關基因的表達而促進脂質分解代謝，并能通過抑制固醇調節元件結合蛋白1c（SREBP1c）、脂肪酸合酶（FAS）、羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGCR）等脂肪合成相關基因的表達而減少脂質的沉積[15-16]。藏花酸，又稱西紅花酸。有研究表明西紅花酸能夠降低高脂血癥動物模型的TC 及TG 含量，其可能機制與選擇性抑制胰脂肪酶活性有關[17]。目前，關于山奈酚抗炎的作用特性研究較多。近年來，研究者逐漸關注到了山奈酚在調節脂代謝方面的作用。Alkhalidy 等[18]研究發現山奈酚能夠促進葡萄糖轉運蛋白4（Glut4）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的表達，參與調節脂肪分解，改善胰島素敏感性和防止胰腺β 細胞功能障礙。豆甾醇則被證實能夠抑制TC 的吸收，減少內源性TC 的合成[19-20]。

網絡藥理學結果顯示，PPAR 信號通路為富集程度最高的通路。因此，筆者選擇富集在PPAR 信號通路上的關鍵信號分子ADIPOQ、PPARα、APOA2進行實驗驗證。ADIPOQ 是一種由脂肪細胞分泌的內源性生物多肽，能夠參與脂肪酸氧化、葡萄糖攝取和糖異生等多種生物過程，調節機體能量代謝[21]，而ADIPOQ 發揮其生物效應主要是通過與ADIPOQ受體結合而實現[11]。因此，對ADIPOQ 受體表達情況的研究有助于更好地了解高脂血癥大鼠脂代謝紊亂的病理機制[22]。AdipoR2 是ADIPOQ 受體之一，主要表達于肝臟組織[12]。與經典的7 層跨膜蛋白不同，AdipoR2 的羧基端位于細胞膜外，可與ADIPOQ 結合；氨基端位于細胞膜內，可與信號接收蛋白結合[23-24]。當AdipoR2 與ADIPOQ 結合，可以促進脂肪酸β 氧化，改善脂代謝紊亂；同時，AdipoR2 又能與膜內的PPARα 信號分子結合，從而激活PPARα 信號通路[12]。PPARs 是受配體調節的轉錄因子，能夠被內源性脂肪酸及其代謝衍生物激活[25]，在細胞的信號轉導過程中發揮至關重要的作用。PPARα 是PPARs 家族中的一員，在維持肝臟脂肪酸代謝穩態中扮演重要角色[26]。脂肪酸的氧化大部分發生在線粒體中，其他部分則是在過氧化物酶體中降解[27]。研究證明，激活的PPARα 能夠上調線粒體中電子傳遞鏈的組分，增加肝臟過氧化物酶體的豐度，從而能夠促進脂肪酸的氧化利用[28-29]。此外，激活的PPARα 能夠與飽和及不飽和脂肪酸結合，增加其下游脂肪酸氧化基因的表達。APOA2 是PPARα 的下游靶基因之一，也是HDL 的主要成分，在指導脂代謝方面發揮重要作用[13，30]。HDL 顆粒主要由載脂蛋白、膽固醇、磷脂和少量脂肪酸組成。其中，組成HDL 顆粒的載脂蛋白主要是APOA1 和APOA2，分別占HDL 總蛋白成分的70%和20%[31-32]。APOA1 能夠與磷脂和非酯化游離膽固醇關聯，在ABCA1 的介導下形成前β-HDL，再經卵磷脂-膽固醇酰基轉換酶（LCAT）的酯化，使游離膽固醇轉化為膽固醇酯，形成成熟的HDL[33-34]。誘導表達的APOA1 能夠增加循環血液中HDL 的水平，從而將外周組織中的TC 轉運到肝臟，最終以膽汁酸的形式排泄。這一過程又被稱為“膽固醇逆向轉運”（RCT）[35]。通過RCT 過程能夠實現機體多余TC 的清除，減少TC 在動脈壁的沉積，從而改善血脂紊亂，發揮心腦血管保護作用。HDL 因此被稱為“血管清道夫”[36]。APOA1 空間構象的改變與HDL 結構重塑和功能實現密切相關。目前雖然關于APOA2 的研究較少，但是已有研究表明APOA2 參與對APOA1 空間構象的調節，導致APOA1 依賴性eNOS 磷酸化減弱，NO 生成減少[37-38]。因此，APOA2含量變化將直接或間接影響HDL 清除TC 的能力，造成內皮功能紊亂[39]。

通過網絡藥理學預測，化濁行血湯抗高脂血癥的作用機制可能為通過槲皮素、藏花酸、山柰酚、豆甾醇等生物活性成分對關鍵靶點INS、ABCA1、TNF、VCAM1、NOS3、PON1、ABCG1、PPARA、PPARG、ADIPOQ、NR1H3、MTTP、ACACA、SELE、APOA2 等進行調節，通過RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、初級胺氧化酶活性等分子功能，在受體復合物、膜筏、球形高密度脂蛋白顆粒等細胞組分中參與對巨噬細胞來源的泡沫細胞分化的負調控、對膽固醇儲存的負調控、對膽固醇外流的正調控等生物過程，以對PPAR、AMPK、PI3K-Akt等信號通路進行干預，從而發揮改善脂代謝紊亂，減輕脂質沉積的作用。對網絡藥理學結果的體內實驗驗證表明，化濁行血湯能夠降低高脂飲食誘導高脂血癥大鼠的TC，TG，LDL-C 的水平，升高HDL-C的水平，改善高脂血癥大鼠的肝臟病理損傷。RTPCR 結果顯示化濁行血湯能夠上調AdipoR2 及PPARα mRNA 的表達水平，下調APOA2 mRNA 的表達水平，表明化濁行血湯抗高脂血癥的機制可能與干預AdipoR2/PPARα/APOA2 信號通路相關。本研究借助網絡藥理學方法，從多成分-多靶點-多通路的角度對化濁行血湯抗高脂血癥的機制進行預測和實驗驗證，為后續深入探究化濁行血湯抗高脂血癥的作用機制提供了基礎實驗依據。