雪松醇調節miR-503-5p/TCF3 軸對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響*

馮燕枝，牛冰，葉貝貝

（鄭州人民醫院乳腺外科，鄭州 450099）

乳腺癌（BC）是最常見的惡性腫瘤之一，也是全球女性癌癥死亡的主要原因[1]。盡管通過手術、化療和放療、內分泌治療等對BC 進行系統治療有一定的效果，但因存在著不良反應、高成本和耐藥性等局限性，因此仍需要開發更有效、毒性更低的新型藥物，優化現有的治療方法，以改善BC 的預后，提高BC 患者的生活質量[2-4]。雪松醇是一種天然倍半萜烯醇，已被證明具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗炎、鎮痛、抗焦慮和抗癌作用[5]。研究發現，雪松醇可抑制膠質母細胞瘤[6]、肺癌[7]、結直腸癌[8]的發生發展。微小RNA（miRNA）表達失調與BC 增殖、遷移和侵襲密切相關，多項報道顯示，多種miRNA 已成為BC 藥物干預的新靶點[9-10]。miR-503-5p 作為重要的miRNA 之一，在胃癌、結腸癌中下調表達，促進其表達可抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化[11-12]。miR-503-5p 在BC 中的作用尚不清楚。T 細胞因子3（TCF3/TCF7L1）在BC 中高表達，并能促進三陰性BC 細胞的增殖、遷移和侵襲[13]。經生物信息學分析顯示，miR-503-5p 與TCF3 之間存在結合位點，推測miR-503-5p 可能通過調節TCF3影響BC 的增殖、遷移和侵襲。但雪松醇通過調節miR-503-5p/TCF3 軸對BC 細胞增殖、遷移和侵襲的影響還不甚清楚，因此本實驗旨在探討雪松醇對BC 細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機制，以期為臨床治療BC 提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本收集、細胞來源和實驗動物 2021 年3 月—2022 年12 月期間收集在本院首次確診為BC 患者的癌組織以及距離癌組織3 cm 處的癌旁組織，共36 對。所有患者均未接受化療或放療等形式的治療，且簽署了知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會的批準（批件號20210018）。人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A 及人BC 細胞MCF7、MDAMB-231、SKBR3 購于美國ATCC。4 周齡SPF 級BALB/c 裸鼠購自鄭州大學（河南省實驗動物中心），許可證號：SCXK（豫）2022-0001，體質量15～20 g。

1.1.2 主要試劑與儀器 雪松醇（貨號J14535），上海金穗生物科技有限公司；噻唑藍比色法（MTT）試劑盒（貨號：MH1001），江蘇麥格生物科技有限公司；細胞轉染試劑盒（貨號：SY0944），北京伊塔生物科技有限公司；DMEM 培養基（貨號：M0108B），上海盈灣生物科技有限公司；細胞蛋白提取試劑盒（貨號：SH-2473），北京凱詩源生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒（貨號：R1200-100）、反轉錄試劑盒（貨號：RP1105）、胸腺嘧啶核苷類似物（Edu）apollo 488 in vitro 試劑盒（貨號：CA1172），北京索萊寶科技有限公司；實時熒光定量PCR 試劑盒（貨號：IBIO-C583），江西艾博因生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：RG029S），上海碧云天生物技術有限公司；兔源一抗增殖細胞核抗原（PCNA，貨號：ab15498-PCNA）、基質金屬蛋白酶-2 （MMP-2，貨號：ab37150）、TCF3 （貨號：ab229605）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，貨號：ab9485）一抗抗體，美國Abcam 公司；辣根酶標記羊抗兔二抗（貨號：XY0650），上海信裕生物科技有限公司；miR-503-5p 引物購自廣州RiboBio；miR-503-5p 抑制劑（miR-503-5p inhibitor） 及對照（inhibitor-NC）、miR-503-5p 模擬物（miR-503-5p mimic）及其對照（mimic-NC）購自上海吉瑪生物公司；多功能酶標儀（型號：LD-96A），山東萊恩德智能科技有限公司；離心機（型號：5424），艾本德中國有限公司；實時熒光定量PCR 儀（型號：CFX96 Touch），上海艾研生物科技有限公司；光學顯微鏡（型號：CX31），日本奧林巴斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將人正常乳腺上皮細胞MCF-10A 及人BC 細胞MCF7、MDA-MB-231、SKBR3 置入DMEM 的培養基中，在恒溫培養箱中常規培養。定期觀察，及時更換新的培養基。用0.25%胰蛋白酶消化傳代，收集對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）法檢測miR-503-5p 表達 組織和細胞的總RNA用TRIzol 試劑提取。以RNA 為模板合成cDNA 后，再以cDNA 為模板配置qRT-PCR 反應體系。miR-503-5p 上游引物：5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTC ATA-3′和下游引物：5′-GTAATACGGTTATCCACGC G-3′；U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；以2-ΔΔCT法計算組織和細胞中miR-503-5p 的相對表達量。

1.2.3 MTT 實驗檢測細胞增殖 將對數生長期細胞以1×104/孔，接種到96 孔板中常規培養，設6 個復孔，培養24 h 后吸去原培養液，加入含0、14、28、56、112、225 μmol/L 雪松醇[5]的培養液48 h 后加入MTT 溶液20 μL/孔，再培養4 h 后，加入二甲基亞砜150 μL/孔，充分震蕩后，在酶標儀上于490 nm 波長處檢測各孔的吸光度（A490）值，細胞增殖抑制率（%）=[（A對照-A實驗）/（A對照-A空白）]×100%。

1.2.4 細胞轉染及干預 將細胞分為control 組（正常培養）、雪松醇組（112 μmol/L 干預）、inhibitor-NC（轉染inhibitor-NC）、miR-503-5p inhibitor 組（轉染miR-503-5p inhibitor），對各組轉染組細胞進行轉染24 h，除control 組外，再用雪松醇進行干預48 h，隨后按照1.2.2 中qRT-PCR 法方法檢測各組miR-503-5p 的表達。

1.2.5 細胞增殖實驗 各組MCF7 細胞在96 孔板上接種，濃度為1×104/孔，設6 個復孔。隨后進行常規培養24、48、72 h 后每孔加入20 μL MTT 溶液。繼續培養4 h 每孔再加入150 μL 的二甲基亞砜，在酶標儀上于490 nm 波長處檢測各孔的OD 值。另取MCF7 細胞接種至96 孔板中，培養24 h 后，每孔加入50 μM Edu 孵育2 h，棄去培養液，加入50 μL 的4%多聚甲醛固定30 min，洗去固定液，每個孔加入100 μL 的1×Apollo 染色反應液，避光孵育30 min后，細胞核用DAPI 溶液復染，熒光顯微鏡下觀察，計算Edu 陽性細胞比例。

1.2.6 Transwell 小室檢測細胞遷移與侵襲 將各組MCF7 細胞使用無血清培養基稀釋，接種至不含有Matrigel 基質膠（遷移實驗）或含有Matrigel 基質膠（侵襲實驗）的Transwell 上室，下室加入完全培養基，24 h 后，用4%多聚甲醛固定30 min，并用0.5%結晶紫染色20 min，顯微鏡下隨機選擇6 個視野細胞計算遷移與侵襲細胞數。

1.2.7 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測PCNA、MMP-2、TCF3 蛋白表達 采用試劑盒提取組織和細胞總蛋白，對蛋白進行定量、電泳分離。轉PVDF膜后室溫封閉2 h，最后再分別加入PCNA（1∶1 000）、MMP-2（1∶2 000）、TCF3（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗在4℃條件下孵育過夜，加入二抗（1∶2 000）在37 ℃條件下孵育90 min。Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算蛋白的相對表達水平。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗 構建TCF3 野生型質粒和突變型質粒（TCF3-WT，TCF3-MUT），將TCF3-WT 和TCF3-MUT 分別與mimic-NC 或miR-503-5p mimic 共轉染于MCF7 細胞，48 h 后用熒光酶標儀檢測熒光素酶活性，并計算螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性比值。

1.2.9 體內腫瘤形成實驗 4 周齡BALB/c 裸鼠適應性飼養1 周后，皮下注射200 μL（5×106）MCF7 細胞懸液，每天觀察腫瘤生長情況，待腫瘤體積達到50 mm3后，將裸鼠分成兩組（10 只/組）：對照組、雪松醇組，雪松醇組皮下注射150 mg/kg 雪松醇，2 d/1 次，共給藥10 次。給藥結束后測量小鼠質量，頸椎脫臼處死小鼠并分離腫瘤，測量腫瘤質量與體積，qRT-PCR 檢測移植瘤組織中miR-503-5p 表達，免疫組化法檢測TCF3、MMP-2 蛋白表達。

1.3 統計學方法 Graphpad Prism 7.0 軟件用于分析數據。數據采用均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-503-5p 與TCF3 在組織和細胞中的表達 與癌旁組織比較，BC 組織中miR-503-5p 表達水平降低（1.00±0.02 vs. 0.25±0.02），TCF3 蛋白表達水平（0.31±0.04 vs. 1.57±0.11）升高（P<0.05），見圖1。與MCF-10A 細胞比較，MCF7、MDA-MB-231、SKBR3 細胞中miR-503-5p 表達水平降低，TCF3 蛋白表達水平升高，且MCF7 細胞中miR-503-5p 表達水平最低，TCF3 蛋白表達水平最高，因此，選擇MCF7 細胞進行轉染實驗，見圖2 和表1。

圖1 Western blot 檢測組織中TCF3 蛋白表達Fig.1 Western blot detection of TCF3 protein expression in tissues

圖2 Western blot 檢測細胞中TCF3 蛋白表達Fig.2 Western blot analysis of TCF3 protein expression in cells

表1 miR-503-5p 與TCF3 在細胞中的表達（±s）Tab.1 Expression of miR-503-5p and TCF3 in cells（±s）

表1 miR-503-5p 與TCF3 在細胞中的表達（±s）Tab.1 Expression of miR-503-5p and TCF3 in cells（±s）

注：與MCF-10A 細胞比較，#P<0.05。

分組nmiR-503-5pTCF3/GAPDH MCF-10A61.00±0.000.27±0.02 MCF760.16±0.01#1.79±0.14#MDA-MB-23160.38±0.04#1.53±0.12#SKBR360.42±0.05#1.45±0.10#

2.2 雪松醇對MCF7 細胞的增殖抑制情況 與0 μmol/L 比較，MCF7 細胞增殖抑制率在14、28、56、112、225 μmol/L 雪松醇處理下以劑量依賴性的方式（6.14±1.15）%、（12.78±2.10）%、（25.58±2.47）%、（43.64±3.12）%、（56.84±3.28）%顯著增加（P＜0.05），本研究選取112 μmol/L 雪松醇進行后續實驗。

2.3 雪松醇對MCF7 細胞中miR-503-5p 表達的影響 與control 組（1.00±0.01）比較，雪松醇組MCF7 細胞中miR-503-5p 表達水平（1.87±0.15）顯著升高（P＜0.05）；與雪松醇組、inhibitor-NC（1.85±0.12）比較，miR-503-5p inhibitor 組MCF7 細胞中miR-503-5p 表達水平（0.15±0.01）顯著降低（n=6，P＜0.05）。

2.4 雪松醇對各組MCF7 細胞增殖的影響 與control 組比較，雪松醇組MCF7 細胞在24、48、72 h的OD490值和Edu 陽性細胞率顯著降低（P＜0.05）；與雪松醇組、inhibitor-NC 比較，miR-503-5p inhibitor組MCF7 細胞在24、48、72 h 的OD490值和Edu 陽性細胞率顯著升高（P＜0.05），見圖3 和表2。

圖3 Edu 染色觀察各組細胞增殖（比例尺=50 μm）Fig.3 Observation of cell proliferation by Edu staining in each group（bar=50 μm）

表2 各組MCF7 細胞OD490 值及Edu 陽性率比較（±s）Tab.2 Comparison of OD490 value and Edu positive rate of MCF7 cells in each group（±s）

表2 各組MCF7 細胞OD490 值及Edu 陽性率比較（±s）Tab.2 Comparison of OD490 value and Edu positive rate of MCF7 cells in each group（±s）

注：與control 組比較，#P＜0.05；與雪松醇組比較，*P＜0.05；與inhibitor-NC 比較，△P＜0.05。

OD490 值Edu 陽性率（%）24 h48 h72 h control 組6 1.17±0.121.28±0.12 1.39±0.14 39.56±2.45雪松醇組6 0.52±0.04# 0.78±0.08# 0.87±0.09# 15.37±1.16#inhibitor-NC 組6 0.53±0.050.76±0.06 0.88±0.07 14.70±1.13 miR-503-5p inhibitor 組 6 0.85±0.08*△ 0.98±0.11*△1.25±0.13*△28.43±2.09*△分組n

2.5 雪松醇對各組MCF7 細胞遷移與侵襲的影響 與control 組比較，雪松醇組MCF7 細胞遷移與侵襲數顯著降低（P＜0.05）；與雪松醇組、inhibitor-NC比較，miR-503-5p inhibitor 組MCF7 細胞遷移與侵襲數顯著升高（P＜0.05），見圖4 和表3。

圖4 Transwell 檢測各組MCF7 細胞遷移與侵襲（比例尺=100 μm）Fig.4 Migration and invasion of MCF7 cells detected by Transwell in each group（bar=100 μm）

表3 各組MCF7 細胞遷移與侵襲細胞數比較（±s）Tab.3 Comparison of the migration and invasion of MCF7 cells in each group（±s）個

表3 各組MCF7 細胞遷移與侵襲細胞數比較（±s）Tab.3 Comparison of the migration and invasion of MCF7 cells in each group（±s）個

注：與control 組比較，#P＜0.05；與雪松醇組比較，*P＜0.05；與inhibitor-NC 比較，△P＜0.05。

分組n遷移細胞數侵襲細胞數control 組6157.26±6.42128.39±5.76雪松醇組663.28±4.21#52.63±3.28#inhibitor-NC 組665.80±4.6354.70±3.61 miR-503-5p inhibitor 組6125.92±5.37*△106.38±4.93*△

2.6 雪松醇對各組MCF7 細胞PCNA、MMP-2、TCF3 蛋白表達的影響 與control 組比較，雪松醇組MCF7 細胞中PCNA、MMP-2、TCF3 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與雪松醇組、inhibitor-NC 比較，miR-503-5p inhibitor 組MCF7 細胞中PCNA、MMP-2、TCF3 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖5 和表4。

圖5 Western blot 檢測MCF7 細胞中PCNA、MMP-2、TCF3 蛋白表達Fig.5 Expression of the PCNA，MMP-2 and TCF3 in MCF7 cells detected by Western blot

表4 各組MCF7 細胞中PCNA、MMP-2、TCF3 蛋白表達比較（±s）Tab.4 Comparison of the PCNA，MMP-2 and TCF3 protein expression in MCF7 cells in each group（±s）

表4 各組MCF7 細胞中PCNA、MMP-2、TCF3 蛋白表達比較（±s）Tab.4 Comparison of the PCNA，MMP-2 and TCF3 protein expression in MCF7 cells in each group（±s）

注：與control 組比較，#P＜0.05；與雪松醇組比較，*P＜0.05；與inhibitor-NC 比較，△P＜0.05。

TCF3/GAPDH control 組6 1.74±0.131.56±0.151.58±0.13雪松醇組6 0.48±0.04# 0.36±0.03# 0.53±0.05#inhibitor-NC 組6 0.51±0.050.39±0.040.51±0.04 miR-503-5p inhibitor 組6 0.96±0.10*△ 0.84±0.07*△ 0.97±0.09*△分組nPCNA/GAPDH MMP-2/GAPDH

2.7 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-503-5p 和TCF3 的靶向關系 經starbase 在線預測顯示，miR-503-5p 與TCF3 基因有靶向結合位點，見圖6。與mimic-NC 和TCF3-WT 共轉染組比較，miR-503-5p mimic 和TCF3-WT 共轉染組的熒光素酶活性降低（P<0.05）；與mimic-NC 和TCF3-MUT 共轉染組比較，miR-503-5p mimic 和TCF3-MUT 共轉染組熒光素酶活性變化無統計學意義（P＞0.05），見表5。

圖6 miR-503-5p 與TCF3 的結合位點與突變位點Fig.6 Binding sites and mutation sites of miR-503-5p and TCF3

表5 各組熒光素酶活性比較（±s）Tab.5 Comparison of luciferase activity in each group（±s）

表5 各組熒光素酶活性比較（±s）Tab.5 Comparison of luciferase activity in each group（±s）

注：與mimic-NC＋TCF3-WT 組比較，#P＜0.05。

分組n熒光素酶活性mimic-NC＋TCF3-WT 組61.02±0.07 miR-503-5p mimic＋TCF3-WT 組60.48±0.04#mimic-NC＋TCF3-MUT 組61.04±0.11 miR-503-5p mimic＋TCF3-MUT 組61.03±0.08

2.8 雪松醇對裸鼠移植瘤生長的影響 小鼠荷瘤實驗結果表明，與對照組比較，雪松醇組小鼠移植瘤質量與體積明顯下降（P<0.05）；qRT-PCR 結果顯示，雪松醇組移植瘤中miR-503-5p 水平升高（P<0.05）；免疫組化檢測結果顯示，雪松醇組移植瘤中，TCF3、MMP-2 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），見圖7、8 和表6。

圖7 各組小鼠剝離的移植瘤Fig.7 Transplanted tumors of mice in each group

圖8 免疫組化檢測移植瘤組織中TCF3、MMP-2 蛋白表達（比例尺=100 μm）Fig.8 Immunohistochemical detection of TCF3 and MMP-2 protein expression in transplanted tumor tissues（bar=100 μm）

表6 各組裸鼠移植瘤生長、miR-503-5p 和TCF3、MMP-2 蛋白表達比較（±s）Tab.6 Comparison of xenograft tumor growth，miR-503-5p and TCF3，MMP-2 protein expression in nude mice in each group（±s）

表6 各組裸鼠移植瘤生長、miR-503-5p 和TCF3、MMP-2 蛋白表達比較（±s）Tab.6 Comparison of xenograft tumor growth，miR-503-5p and TCF3，MMP-2 protein expression in nude mice in each group（±s）

注：與對照組比較，#P<0.05。

分組動物數 小鼠體質量（g） 移植瘤體積（mm3） 移植瘤質量（g） miR-503-5pTCF3 陽性率（%）MMP-2 陽性率（%）對照組1026.14±1.751 438.46±195.721.16±0.131.03±0.1036.76±2.4143.65±3.12雪松醇組1025.83±1.48562.79± 96.14#0.47±0.05#1.92±0.15#15.92±1.72#17.38±1.58#

3 討論

BC 因其高病死率和發病率而成為女性的主要健康問題，即使使用輔助化療，轉移性BC 的30 年生存率也低于1%[14]。因此，揭示BC 發生的關鍵分子機制，對于提高BC 患者的診斷和治療水平具有重要意義。

雪松醇因具有良好的抗腫瘤活性而備受關注。雪松醇通過誘導細胞周期停滯和細胞凋亡抑制體內體外結直腸癌、肺癌的生長，被認為是治療結直腸癌、肺癌的有效藥物[5，7]。Chang 等[6]研究發現，雪松醇通過誘導細胞內活性氧（ROS）生成、觸發DNA 損傷和阻斷雄激素受體的核易位，有效抑制膠質母細胞瘤細胞生長。此外研究發現，雪松醇通過阻斷絲蘇氨酸蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途徑降低膠質母細胞瘤對替莫唑胺的耐藥性，通過質膜脂質筏的失穩增強癌細胞化療的敏感性[6，15]。本研究發現，雪松醇降低MCF-7 細胞OD490值、Edu 陽性細胞率、遷移與侵襲數、PCNA、MMP-2蛋白表達水平和移植瘤質量。提示，雪松醇可抑制MCF7 細胞增殖、遷移和侵襲，具有抗BC 的作用。

越來越多的證據表明miRNAs 可作為癌癥的診斷標志物和治療靶點[16]。miR-503-5p 在多數腫瘤中呈低表達，發揮抗癌基因的作用，如在胃癌、結腸癌、卵巢癌、胰腺癌中低表達，過表達miR-503-5p后可抑制腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲等惡性行為。本研究發現，miR-503-5p 在BC 組織和細胞中低表達，雪松醇可促進miR-503-5p 在MCF7 細胞和移植瘤中的表達，并且抑制miR-503-5p 表達后，可逆轉抑制雪松醇對MCF7 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。推測雪松醇可能通過上調miR-503-5p 表達，從而抑制BC 細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA 通過與靶mRNA 內的互補序列進行堿基配對，在基因表達的轉錄后調控中發揮作用。經生物信息學分析顯示，miR-503-5p 與TCF3 之間存在結合位點，雙熒光素酶報告基因實驗證實了miR-503-5p 與TCF3 之間存在靶向關系。TCF3 是Wnt 通路相關T 細胞特異性轉錄因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）轉錄因子家族的成員。研究表明，TCF3在包括BC 在內的多種腫瘤中發揮促癌作用[13]。然而，致癌驅動因素TCF3 如何影響BC 進展的分子機制尚未完全闡明。本研究發現，TCF3 蛋白在BC 組織中和細胞中高表達，雪松醇可下調TCF3 在MCF7細胞和移植瘤中的表達，而抑制miR-503-5p 表達后，TCF3 蛋白表達水平升高，減弱了雪松醇對TCF3蛋白表達的抑制作用，證實了雪松醇可能通過上調miR-503-5p 表達來下調TCF3 蛋白表達，進而抑制BC 細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，雪松醇能抑制BC 細胞增殖、遷移和侵襲，其機制可能與調控miR-503-5p/TCF3 軸有關，miR-503-5p/TCF3 軸可能成為治療BC 的新靶點，然而本研究尚存在不足之處，僅驗證了雪松醇調控miR-503-5p/TCF3 軸對BC 細胞增殖、遷移和侵襲的作用，而未對其他靶點和通路進行驗證，后續需要進一步開展研究。