矢志方激活Sirt1-Foxo1 通路調控內質網應激相關蛋白改善高尿酸血癥小鼠腎損傷*

楊楓，王傳旭，吳志遠，張栩銘，高建東

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海中醫藥大學中醫腎病研究所，上海中醫藥大學肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫臨床重點實驗室，上海 201203）

高尿酸血癥（HUA）是由于嘌呤代謝紊亂導致血清尿酸（UA）升高的代謝綜合征，對人體心腦血管、關節、腎臟等器官造成損害[1-2]。隨著人們生活水平的提高，HUA 的發病率逐年升高，UA 長期堆積在腎臟會引起腎小管間質纖維化，從而引發UA 性腎病[3]。臨床一線降UA 藥物如黃嘌呤氧化酶抑制劑非布司他、別嘌呤醇，促進UA 排泄藥物苯溴馬隆等，長期服用存在一定副作用、血清UA 控制不佳等問題[4]。

沉默信息調節因子1（Sirt1）/叉頭轉錄因子1（Foxo1）信號通路與腎臟病理生理發展密切相關。Sirt1 在腎臟中廣泛存在，激活Sirt1 可抑制Foxo1 乙酰化水平，對腎臟起保護作用。Sirt1 表達增加可減輕草酸鈣晶體誘導的腎損傷[5]，緩解脂多糖所導致的氧化應激引起的腎損傷[6]。內質網應激（ERS）是維持細胞內穩態的重要細胞器，腎小管上皮細胞損傷是一種病理和生理的改變，在HUA 早期和進展期發揮關鍵作用[7]。在正常情況下，適度ERS 能保護細胞活性，如果長時間高UA 刺激則會超出內質網代償能力，造成細胞損傷[8]。

矢志方是上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎病科臨床經驗方。臨床療效較好，能顯著降低痰濁瘀阻型HUA 的UA 水平[9]。前期大量基礎實驗研究表明，矢志方能降低HUA 小鼠和HUA 大鼠UA 水平、改善HUA 小鼠和HUA 大鼠腎功能[10-13]。基于本課題組前期研究基礎，本實驗通過建立HUA 小鼠模型，觀察基于Sirt1-Foxo1 通路矢志方對HUA 小鼠腎組織和高UA 誘導HK2 細胞ERS 相關蛋白表達的影響，以期為矢志方的臨床應用提供更多實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物 選取32 只8 周齡SPF 級雄性BALB/c小鼠，體質量12～22 g，購自上海斯萊克實驗動物，動物許可證號SCXK（滬）2017-0005，倫理證號PZSHUTCM211227011。在上海中醫藥大學實驗動物中心飼養，溫度25 ℃左右，濕度45%左右，12 h 光照，普通飲食飲水喂養。

1.2 實驗細胞 人腎小管上皮細胞HK2，購自中國科學院細胞庫。

1.3 實驗藥物 動物用藥：矢志方（車前子30 g，芥子15 g，王不留行15 g，冬葵子15 g），飲片購自上海中醫藥大學附屬曙光醫院，并委托國家中藥制藥工程技術研究中心制備成中藥復方顆粒劑（1 g 顆粒相當于原方20 g），用蒸餾水配制成70 mg/mL 藥液。非布司他片，40 mg/片，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號H20130081，用蒸餾水配制成0.75 mg/mL藥液。

矢志方凍干粉制作流程：稱取炒王不留行、炒芥子各3.6 kg，炒車前子7.2 kg，冬葵子3.6 kg，混合均勻，打粉，粉碎后加入藥材10 倍體積純凈水包煎，先煮1 h，過濾，再加8 倍水浸泡1 h，加熱回流提取2 次，每次1 h。最終得到凍干粉0.9 kg。

細胞用藥矢志方溶液配制：50 mL 試管中加入10 mL 含10%胎牛血清（FBS）、1%P/S 的F12/DMEM完全培養基，稱取矢志方干粉600 mg，加入到試管中，細胞裂解儀30%功率5 min 促進干粉溶解，矢志方溶液終濃度為60 mg/mL。

UA 配置：稱取100 mg UA 加入10 mL 雙蒸水，震蕩混勻充分溶解后濾過使用，UA 溶液終濃度為10 mg/mL。

1.4 主要試劑與儀器 氧嗪酸鉀、羧甲基纖維素鈉（CMCC-Na），上海麥克林生化科技有限公司，貨號分別為P831461、C10097951；UA，美國Sigma 公司，貨號u2875-5 g；Sirt1，美國CST 公司（貨號8469s）；內質網跨膜蛋白肌醇酶1α（IRE1α），美國CST 公司（貨號3294s）、武漢Abclonal 公司（貨號A17940）；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）12，美國Signalway Antibody 公司（貨號48277）、武漢Abclonal 公司（貨號A22864）；增強子結合蛋白同源蛋白（Chop），美國CST 公司（貨號2895s）、武漢Abclonal 公司（貨號A113466）；Foxo1，美國CST 公司（貨號2880s）；GAPDH，美國Proteintech 公司（貨號60004-I-Ig）；α-Tubulin，上海碧云天公司，貨號AF2827；HRP 標記山羊抗小鼠IgG、HRP 標記山羊抗兔IgG，上海碧云天公司，貨號分別為A0216、A0208；PVDF 膜，美國Millipore 公司，貨號IPVH00005。離心機，美國Beckman 公司，型號Avanti J-E；凝膠成像系統，上海天能生命科學有限公司，型號Tanon-5200；生物組織冷凍包埋機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號KD-BM；烘片機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號KD-H；酶標儀，美國BioTek 公司，型號Synergy 2；組織勻漿器，上海凈信科技有限公司，型號JY-24；顯微鏡，日本奧林巴斯公司，型號CX33。

2 實驗方法

2.1 動物分組、造模與給藥 造模及給藥方法參考文獻[8]，32 只小鼠適應性飼養1 周后，隨機分為正常組、模型組、非布司他組和矢志方組，每組8 只。正常組用同等體積生理鹽水灌胃，其余各組采用250 mg/kg 氧嗪酸鉀溶液灌胃建立HUA 小鼠模型。4 h 后給予藥物干預即非布司他組灌胃非布司他藥液6 mg/kg，矢志方組灌胃矢志方藥液562.5 mg/kg，參考《中藥藥理實驗方法學》的人與小鼠藥物換算方式和本課題組前期實驗，每只小鼠每10 g 灌胃0.2 mL，每日1 次，正常組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，造模與給藥同時進行，連續2 周。

2.2 細胞培養與造模方法 將HK2 細胞用含10%FBS 和1%雙抗的DMEM/F12 培養基于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，細胞密度為90%時進行細胞傳代，取對數生長期細胞進行細胞鋪板，細胞貼壁后用含0.5%FBS 的DMEM/F12 培養基饑餓處理12 h，再進行相應干預，干預24 h 后處理細胞進行后續實驗。將細胞分為正常組，模型組（200 μg/mL UA），中藥組（200 μg/mL UA＋300 μg/mL 失志方）。

2.3 取材 第14 日給藥結束后，0.8%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，摘取雙側腎臟分別用于病理觀察、蛋白免疫印跡法（Western blot）實驗和免疫熒光染色。

2.4 病理觀察 小鼠腎臟組織經4%多聚甲醛組織固定液固定24 h，梯度脫水、浸蠟、包埋，4 μm 厚度切片，37 ℃烤片12 h，然后進行蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson 染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察小鼠腎臟組織病理形態。

2.5 Western blot 檢測 取20 mg 小鼠腎組織，加入RIPA 裂解液200 μL，勻漿機65 Hz 勻漿1 min，4 ℃、12 000 rpm 離心15 min，離心半徑6 cm。BCA 法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液和生理鹽水配制成濃度為40 μg/μL 的等量蛋白樣品。上樣，120 V 電泳1 h，300 mA、1 h 30 min 轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入IRE1α 一抗（1∶1 000）、Sirt1一抗（1∶1 000）、Foxo1 一抗（1∶1 000）、Caspase 12 一抗（1∶1 000）、Chop 一抗（1∶1 000）、α-Tubulin 一抗（1∶1 000）、GAPDH 一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜；PBST 洗膜3 次，加入HRP 標記的山羊抗小鼠IgG（1∶1 000）、山羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫孵育1 h；PBST 洗膜3 次，ECL 化學發光法顯影，凝膠成像系統拍攝。以GAPDH 和α-Tubulin 為內參，計算目的蛋白相對表達量。

2.6 免疫熒光染色 細胞經爬片、干預結束后，4%多聚甲醛室溫固定爬片細胞30 min，室溫通透細胞20 min，加入1%BSA 室溫封閉60 min，加入稀釋的IRE1α 一抗（1∶200）、Sirt1 一抗（1∶1 000）、Foxo1 一抗（1∶1 000）、Caspase 12 一抗（1∶400）、Chop 一抗（1∶400），4 ℃孵育過夜；加入熒光二抗（1∶500），避光孵育1 h，加入DAPI 染細胞核5 min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

2.7 免疫組化染色 腎組織石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，3%牛血清白蛋白溶液（BSA）室溫封閉30min，加入IRE1α 一抗（1∶100）、Sirt1 一抗（1∶100）、Foxo1一抗（1∶100）、Caspase12 一抗（1∶100）、Chop 一抗（1∶100）。4 ℃孵育過夜，加二抗室溫孵育50 min，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，中性樹脂封片，光鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽性表達。

3 統計學方法

采用SPSS22.0 統計軟件和Image J 1.8 軟件進行分析。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多重比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05 表示有統計學意義。

4 結果

4.1 矢志方對模型小鼠腎組織病理形態的影響 與正常組比較，模型組小鼠腎組織結構紊亂，腎小管管腔擴張、管壁變薄，腎間質炎性細胞浸潤，大量藍色膠原纖維沉積；與模型組比較，矢志方組和非布司他組小鼠腎小管管腔擴張、炎性細胞浸潤、藍色膠原纖維集聚程度減少。見圖1。

圖1 各組小鼠腎組織形態（×400）Fig.1 Pathological changes of mouse kidney tissue in each group（×400）

4.2 矢志方對高UA 小鼠腎組織和高UA 誘導HK2 細胞Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表達的影響 Western blot 結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠腎組織IRE1α、Foxo1、Caspase12、Chop 蛋白表達顯著升高（P<0.01 或P<0.001），Sirt1蛋白表達顯著降低（P<0.001）；與模型組比較，非布司他組小鼠腎組織和矢志方組小鼠腎組織IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表達顯著降低（P<0.001），Sirt1 蛋白表達顯著升高（P<0.001）。細胞Western blot 結果與HUA 小鼠腎組織Western blot結果趨勢一致，見圖2，圖3。

圖2 各組HK2 細胞Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表達情況（±s）Fig.2 Protein expressions of Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop in HK2 cells of each group（±s）

圖3 各組小鼠腎組織Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表達情況（±s）Fig.3 Protein expressions of Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop in mouse kidney tissue of each group（±s）

4.3 矢志方對高UA 小鼠小鼠腎組織Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 表達的影響 免疫組化染色結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠腎組織IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 表達顯著升高（P<0.01 或P<0.001），Sirt1 表達顯著降低（P<0.001）；與模型組比較，非布司他組和矢志方組小鼠腎組織IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 表達顯著降低（P<0.05，P<0.01 或P<0.001），Sirt1 表達顯著升高（P<0.05）。見圖4。

圖4 各組小鼠腎組織Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase12、Chop 陽性表達情況（免疫組化染色，×400）Fig.4 Postive expressions of Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase12、Chop in mouse kidney tissue of each group（Immunohistochemical staining，×400）

4.4 矢志方對高UA 誘導HK2 細胞Sirt1、IRE1α、Foxo1、Caspase12、Chop 表達的影響 免疫熒光染色結果顯示，與正常組比較，模型組細胞IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 表達顯著升高，Sirt1 表達顯著降低；與模型組比較，矢志方組細胞IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 表達顯著降低，Sirt1 表達顯著升高。見圖5-9。

圖5 各組HK2 細胞Sirt1 陽性表達（免疫熒光染色，×400）Fig.5 Postive expressions of Sirt1 in HK2 cells of each group（Immunofluorescence staining，×400）

圖6 各組HK2 細胞IRE1α 陽性表達（免疫熒光染色，×400）Fig.6 Postive expressions of IRE1α in HK2 cells of each group（Immunofluorescence staining，×400）

圖7 各組HK2 細胞Foxo1 陽性表達（免疫熒光染色，×400）Fig.7 Postive expressions of Foxo1 in HK2 cells of each group（Immunofluorescence staining，×400）

圖8 各組HK2 細胞Caspase 12 陽性表達（免疫熒光染色，×400）Fig.8 Postive expressions of Caspase 12 in HK2 cells of each group（Immunofluorescence staining，×400）

圖9 各組HK2 細胞Chop 陽性表達（免疫熒光染色，×400）Fig.9 Postive expressions of Chop in HK2 cells of each group（Immunofluorescence staining，×400）

5 討論

HUA 引起腎損傷的機制十分復雜，主要包括氧化應激、內皮功能障礙、腎纖維化和炎癥[3]。本課題組前期研究發現矢志方臨床療效顯著，前期基礎實驗研究表明，矢志方能抑制白細胞介素-1β（IL-1β）IL-1β 表達、促進有機陰離子轉運蛋白1/3（OAT1/3）、肝細胞核因子1α/4α（HNF1α/4α）表達減輕HUA 小鼠腎臟損傷。ERS 與腎損傷密切相關[14-15]，本研究中發現ERS 的調節因子Sirt1 在HUA 小鼠腎組織中顯著下調，給予矢志方干預后能上調Sirt1 表達水平、矢志方還能抑制ERS、改善腎損傷和間質纖維化。因此，Sirt1 和ERS 可能是HUA 誘導的腎間質纖維化的潛在治療靶點。

內質網是一個表型和功能多樣的傳感平臺，與調節蛋白沉積、脂質代謝、糖異生和鈣信號傳導等多種細胞功能密切相關，是維持和恢復代謝健康的重要組成部分。內質網穩態的紊亂通常被稱為ERS，ERS 是一種功能失衡狀態，通過激活內質網激酶（PERK）/真核起始因子2α（eIF2α）途徑中C/EBP同源蛋白（Chop）、IRE1α-凋亡信號調節激酶1（ASK1）-c-Jun N 端激酶（JNK）通路、IRE1α-X 盒結合蛋白1（XBP1）-Chop 通路、激活Caspase 12 通路調控細胞凋亡。輕度ERS 時，內質網可通過激活未折疊蛋白反應途徑（UPR）啟動自噬以恢復內質網穩態，促使細胞存活；當ERS 刺激過強且持續存在時，會過度誘導自噬或激活凋亡途徑使細胞死亡。

UPR 包括重建內質網穩態的途徑以及觸發凋亡的途徑，即轉錄因子依賴和Caspase 12 依賴的途徑[16]。在轉錄因子依賴的途徑中，葡萄糖調節蛋白78（GRP78）在ERS 激活時與IRE1 解離，IRE1α 的管腔結構域感知未折疊蛋白的積累，從而導致其二聚化和自身磷酸化。這激活了其胞質內核糖核酸酶活性，啟動了兩個獨立的事件來恢復蛋白沉積。一個是通過調節的IRE1 依賴性衰變（RIDD）降解mRNAs，通過IRE1α 切割并去穩定內質網定位的mRNAs，從而減少新合成的蛋白質進入內質網腔所產生的折疊負擔。另一種是X 盒結合蛋白-1（XB P1）mRNA 的非規范特異性剪接[17]，XBP1s 還通過絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）信號的磷酸化在蛋白質水平上受到調節[18]。UPR 的IRE1α-XBP1 途徑是維持代謝穩態的關鍵因素[19-22]。在Caspase 12 依賴性途徑中，鈣離子（Ca2+）從細胞內儲存到胞質溶膠，導致鈣蛋白酶轉移到內質網，使Caspase 12 活化，然后通過Caspase 9 的激活，誘導Caspase 3 依賴的凋亡途徑，以促進細胞凋亡[23]。另外，IRE1 通過上調Chop 轉錄因子，一方面，活化的Chop 上調B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）家族促凋亡蛋白Bax 發揮促凋亡作用；另一方面，Chop 促進TRAIL 受體2（DR5）的轉錄，活化Caspase 8 依賴的外源途徑的細胞凋亡。表明Chop 在靶向ERS 激誘導的細胞凋亡中發揮了關鍵作用[24]。本研究發現矢志方能在體內體外下調IRE1α、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表達水平，表明矢志方能通過抑制ERS 緩解腎臟損傷。

Sirt1 是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的組蛋白去乙酰化酶，參與代謝、衰老、細胞存活、自噬和糖尿病的調節。Sirt1 通過去乙酰化激活各種蛋白質和轉錄因子。Foxo1 是其中一個被Sirt1 去乙酰化的轉錄因子，參與細胞的氧化應激抵抗、細胞凋亡、細胞周期阻滯、胰島素信號轉導和代謝等[25]。有研究報道，Sirt1 存在于細胞核中，但它可以穿梭到細胞質中，作為組蛋白的去乙酰化酶，以及許多非組蛋白靶點[26]。受Sirt11 調控的Foxo 轉錄因子的乙酰化狀態可以選擇性地將Foxos 定向到特定的靶點，是代謝和應激反應的另一個調控途徑[27]。進一步的研究報道，Foxo1 被Sirt1 介導的賴氨酸242、245 和262 的脫乙酰化激活[28]。因為到目前為止已經證明Sirt1 通過調節Foxos 的表達來防止ROS 產生和氧化應激，但是也已經提出增加的氧化應激可以反過來控制Sirt1 活性，但是Foxo 參與該活性的可能性還不清楚[29]。Sirt1 在調節ERS 方面發揮了重要作用，它可通過調控內質網相關分子PERK、GRP78 緩解ERS 減輕阿霉素引起的心臟毒性[30]。本研究結果表明Sirt1 在受高UA 刺激后表達降低，而矢志方能顯著激活Sirt1 水平，改善腎臟損傷，并且下調ERS 相關蛋白，說明Sirt1 可通過調控ERS 減輕HUA 所導致的腎損傷。

綜上所述，矢志方可減輕HUA 小鼠腎臟損傷，其機制與激活Sirt1-Foxo1 通路抑制ERS 相關蛋白及下游Chop、Caspase 12 蛋白表達有關。然而，HUA引發ERS，以及進一步導致腎損傷并沒有完全了解，還有待進一步研究。