焙烤及油炸食品中賴丙氨酸檢測方法的建立及監測

潘強，李燕妹，梁敏，黃燕，吳麗倩，陳集元，蔡小明

（福建省產品質量檢驗研究院 國家加工食品質量檢驗檢測中心，福建 福州 350002）

隨著生活水平的提高，人們對食品的消費理念逐漸從吃飽吃好的生存型消費轉變成健康、營養、多樣化的享受型消費，越來越多的消費者追求吃得更健康、更安全。熱加工是食品生產過程中必不可少的環節，其不僅能夠賦予食品良好的口感、香味、外觀，而且能夠延長食品的保質期，但這一過程往往伴隨著蛋白質變性、脂質氧化、維生素降解等，并生成一些有害物質[1,2]。賴丙氨酸就是食品熱加工過程中產生的有害物質之一。富含蛋白質的食品經過高溫[3-7]或堿處理[8-10]會產生賴丙氨酸，大量消耗掉食品中必需氨基酸，降低食品的營養價值[11,12]，同時螯合金屬酶，使生物體內礦物質利用率降低，造成機體金屬元素營養失調，此外賴丙氨酸還會對動物機體產生腎毒性[13]。目前在食品法規中沒有明確表明賴丙氨酸的危害性及安全限量，但是在嬰幼兒配方食品中，賴丙氨酸已經開始作為一個質量控制指標，以避免對嬰幼兒造成傷害[14,15]。

焙烤及油炸類食品品種多樣、味道各異，深受我國消費者喜愛，具有食用范圍廣、頻率高等特點。目前，我國對食品中賴丙氨酸的研究主要集中在皮蛋[16]、牛奶[17-18]和嬰幼兒配方食品，對于焙烤及油炸類食品中賴丙氨酸含量的檢測及監控存在一定的空白。本文構建了焙烤及油炸食品中賴丙氨酸的氨基酸分析儀檢測方法，該方法能夠方便快速、準確地對焙烤及油炸類食品中賴丙氨酸含量的進行測定，有利于監測焙烤及油炸食品中的賴丙氨酸的含量，對保障消費者的食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

L-8900 氨基酸分析儀（日立公司）；電子天平（0.01 g，賽多利斯有限公司）；MS 3 basic微量振蕩器（德國艾卡公司）；Avanti J-E高速冷凍離心機（賽默飛有限公司）；Milli-Q超純水純化系統（美國密理博公司）；全自動平行濃縮儀（?？苾x器有限公司）；DHG -9140A 恒溫干燥箱（上海精宏試驗設備有限公司）。

賴丙氨酸（1000 mg/L，CAS:4418-81-9）：天津阿爾塔科技有限公司。17種氨基酸混合標準溶液（2.50 μmol/mL）：富士膠片和光純藥株式會社東京工廠。

焙烤食品（面包、餅干等）和油炸食品（薯片、沙琪瑪、麻花等）均為市售品。

1.2 標準溶液配制

將1000 mg/L的賴丙氨酸標準品用水稀釋成質量濃度為0.50、1.00、5.00、10.0、50.0 mg/L的系列標準溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品直接酸水解

準確稱取1.00 g（精確至 0.01g）粉碎后樣品于25 mL水解管中，加入10 mL濃度為6 mol/L的HCl溶液，密封，110 ℃下水解24 h。

1.3.2 樣品按脫脂、酸水解蛋白的步驟處理準確稱取1.00 g（精確至 0.01g）粉碎后樣品置于50 mL離心管中，加入正己烷10 mL，渦旋離心棄去正己烷層，重復上述步驟2次并氮吹去除正己烷。脫脂后的樣品用濃度為6 mol/L HCl的溶液10 mL轉移至 25 mL水解管中，110 ℃下水解24 h。

1.3.3 樣品按脫脂、還原、酸水解蛋白的步驟處理

準確稱取1.00 g（精確至0.01g）粉碎后樣品置于50 mL離心管中，加入正己烷10 mL，渦旋離心棄去正己烷層，重復上述步驟2次并氮吹去除正己烷。脫脂后的樣品加入10 mL硼砂鹽緩沖溶液（0.2 mol/L）渦旋混勻，再加入1 mL硼氫化鈉溶液（2.0 mol/L），混勻后4 ℃冷藏過夜。離心，棄去上清液。將樣品用10 mL，濃度6 mol/L的HCl溶液轉移至25 mL水解管中，110 ℃下水解24 h。

1.3.4 用水直接提取

準確稱取1.00 g（精確至0.01 g）粉碎后樣品于10 mL容量瓶中，加入5 mL水超聲提取20 min，之后用水定容至10 mL，測定樣品中游離的賴丙氨酸。

水解管取出自然冷卻后將水解液轉移至25 mL容量瓶中，并用水定容搖勻、過濾。準確分取5.00 mL濾液于10 mL比色管中，用質量分數為50%的NaOH溶液調pH值為5.0～6.0，用水定容至10 mL， 渦旋混勻備用。

1.4 儀器條件

1.4.1 氨基酸分析儀條件

色譜柱：HITACHI 陽離子交換柱（60 mm×4.6 mm×3μm）。

流動相：A相為檸檬酸鈉溶液（0.020 mol/L，pH3.3）；B相為檸檬酸鈉溶液（0.026 mol/L，pH3.2）；C相為檸檬酸鈉溶液（0.045 mol/L，pH4.0）；D相為檸檬酸鈉溶液（0.091 mol/L，pH4.9）；E相為再生液。柱后衍生劑：R1茚三酮溶液；R2緩沖液；R3乙醇溶液（5%）。

梯度洗脫程序為：0～2.5 min，100% A；2.6～5.0 min，100 %B；5.1～12.8 min，100% C；12.9～27.0 min，100%D；27.1～33.0 min，100%E；33.1～34.0 min，100 %B；34.1～53.0 min，100%A。（流速0.40 mL/min）。

衍生程序：0～32.0 min，50%R1+50%R2；32.1～37.0 min，100% R3；37.1～53.0 min，50 %R1+50%R2（流速0.35 mL/min）。

檢測波長：570 nm；進樣量：20 μL；柱溫：57 ℃；衍生溫度：135 ℃。

1.4.2 液相色譜-質譜條件

色譜柱：Waters BEH C18 (1.7μm，2.1 mm×100 mm)；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈；進樣量5 μL；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；梯度洗脫程序：0～5 min，95%～60% A；5.1～8 min，0%A；8.1～10 min，95% A。

離子源：電噴霧離子源（ESI-源）；離子源溫度：350 ℃；監測模式：多反應監測模式；定量離子m/z 234.1＞84.1，定性離子m/z 234.1＞130.1。

2 結果與分析

2.1 系統適用性和專屬性試驗

分別取賴丙氨酸標液、賴丙氨酸及17種氨基酸混合標準品溶液、樣品溶液按1.4.1的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1）。從圖1A、圖1B可以看出，在1.4.1所示色譜分析條件下，賴丙氨酸和16種混合氨基酸均能實現基線分離，且分離度大于1.5。圖1C顯示，實際樣品檢測不存在干擾峰。綜上，在該氨基酸分析儀的分析條件下，其他氨基酸組分或樣品成分對賴丙氨酸含量的測定無干擾，表明所用方法的專屬性良好。

圖1 標準溶液（A、B）和樣品溶液（C）的色譜圖

2.2 前處理條件的優化

以薯片為樣品，比較4種不同樣品前處理方法對目標物檢測結果影響（見表2）。結果表明，未經正己烷脫脂處理的樣品（方法①）測得的賴丙氨酸含量與經過正己烷脫脂處理的樣品（方法②）沒有顯著性差別（p＞0.05），未經正己烷脫脂處理的樣品并未對賴丙氨酸造成干擾，但對前10 min出峰的氨基酸產生了干擾，影響了對其他氨基酸組分的同時監測，此外，焙烤及油炸食品油脂含量較高，為避免油脂對色譜柱的損害，需將樣品進行脫脂處理。未經NaBH4還原處理的樣品（方法②）測得的賴丙氨酸含量與經過NaBH4還原處理的樣品 (方法③)沒有顯著性差別（p＞0.05），說明高溫酸性水解過程并不會促使新的賴丙氨酸生成，使樣品中賴丙氨酸的測定值偏高，因此無須對樣品進行NaBH4還原處理。方法④未檢測到樣品中游離的賴丙氨酸，說明在食品中賴丙氨酸主要以結合態的方式存在，需要對樣品進行水解才能得到賴丙氨酸。

表2 不同處理方式測得的賴丙氨酸含量（n=3）

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線和檢出限、定量限

配制 0.50～50.0 mg/L 的6個系列濃度點的賴丙氨酸標準溶液，按色譜條件（1.4.1）進行測定。以測定賴丙氨酸的質量濃度（X，mg/L）為橫坐標，賴丙氨酸的峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，目標物在0.50～50.0 mg/L的線性范圍內具有良好的線性關系，相關系數r為0.9999，標準擬合方程為y=1.75×105x+3.39×103。根據3倍信噪比和10倍信噪比計算出賴丙氨酸的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為3.33 mg/kg和10.0 mg/kg。

2.3.2 加標回收率試驗

試驗發現烘焙及油炸類食品中均含有賴丙氨酸，因此取面包、薯片和餅干3類樣品作為代表性樣品，進行3水平3平行的加標試驗，結果見表3。由表3可知，該方法加標回收率范圍為86.3%～91.3%，RSD為1.47%～4.26%。可見該方法具有良好的準確度和精密度，適用于烘焙及油炸類食品中賴丙氨酸的測定。

表3 不同烘焙及油炸類食品中賴丙氨酸的加標回收率與相對標準偏差（n=3）

2.4 目標物的確證

氨基酸分析儀法采用保留時間定性，當檢出結果存在不確定因素時，可采用LC-MS/MS進一步確證，儀器參數見“1.4.2”，其多反應監測（MRM）圖見圖2，賴丙氨酸目標物可能裂解途徑見圖3。

圖2 賴丙氨酸的MRM圖

圖3 賴丙氨酸可能裂解途徑

2.5 實際樣品檢測

應用本方法對市售面包、薯片、餅干、麻花、蛋糕及沙琪瑪共計30批次樣品進行檢測，試驗結果如表4所示。

表4 市售焙烤及油炸類食品中賴丙氨酸的實測含量（n=3）

實驗結果表明，油炸類食品中賴丙氨酸的含量遠高于焙烤類，油炸類食品薯片、麻花和沙琪瑪等中賴丙氨酸含量在79.5～250.7 mg/kg之間。焙烤類食品面包、蛋糕、餅干賴丙氨酸的含量在 11.2～101.6 mg/kg之間。結果也表明同類食品中生產工藝的不同，如加熱溫度的高低、時間的長短等也會使產品中賴丙氨酸含量有很大區別，如采用較低溫度制作的蒸蛋糕（蛋糕1和蛋糕5）中賴丙氨酸的含量明顯低于高溫烘烤的蛋糕（蛋糕5）。

目前，國家食品安全標準尚未對賴丙氨酸含量進行限制，但其潛在的危害性不容小覷，因此，建議有關部門對焙烤及油炸類食品中的賴丙氨酸進行監測，促使生產企業優化生產工藝條件，減少生產過程中賴丙氨酸的生成。

3 討論

賴丙氨酸的形成機制主要包括2步：第一步是蛋白質中的胱氨酸、半胱氨酸、絲氨酸或磷絲氨酸殘基通過β-消除反應生成脫氫丙氨酸殘基；第二步是含有共軛雙鍵的脫氫丙氨酸殘基與蛋白質中的賴氨酸殘基ε-氨基發生交聯反應生成賴丙氨酸[16,20]。加熱和堿處理是形成賴丙氨酸的2大因素，隨著研究深入，發現食品加工方式、食品組分、滅菌方式、食品儲存條件等都會促使賴丙氨酸的生成，但賴丙氨酸形成是可以在食品加工過程中通過控制加工工藝進行控制。如適度降低pH值，減少游離氨基酸的生成，控制蛋白質交聯反應的發生[8,10]；在保證食物質量的基礎之上，降低加熱溫度，縮短加熱時間[17,21]；在生產過程中加入碳水化合物使其與蛋白質發生美拉德反應，消耗賴氨酸的ε-氨基[22]；使用高壓條件使蛋白質分子空間結構產生變化，阻礙氨基酸之間的交聯；減少產品的貨架期[23]等均能有效控制食品加工過程中賴丙氨酸的產生。

4 結論

本文建立了焙烤和油炸食品中賴丙氨酸的氨基酸分析儀檢測方法。該檢測方法賴丙氨酸的定量限為10.0 mg/kg，加標回收率為86.3%～91.3%，相對標準偏差（RSD）為1.47%～4.26%，方法簡便、準確、穩定，還可以同時測定多種氨基酸，可應用于焙烤和油炸食品中賴丙氨酸含量的測定，對優化食品加工工藝條件、保證食品安全及保障消費者身體健康具有重要的指導意義。