不同倍性藍(lán)靛果葉片活性成分含量分析

盛煜鈞

摘? ?要? ?以二倍體、四倍體、八倍體藍(lán)靛果組培苗及大田苗為試材，采用分光光度法測(cè)定并分析了藍(lán)靛果葉片生理活性成分含量差異，為多倍體藍(lán)靛果植株的早期篩選提供了依據(jù)。結(jié)果表明：藍(lán)靛果葉片中花青素、類(lèi)黃酮和總酚含量隨倍性升高而升高，八倍體含量顯著高于二倍體和四倍體，四倍體明顯高于二倍體，組培苗和大田苗趨勢(shì)一致。Vc含量隨倍性增加逐漸減少，二倍體和八倍體有明顯差異，二倍體和四倍體有差異但不明顯。隨倍性增加，葉片中葉綠素含量升高，且不同倍性總?cè)~綠素含量存在顯著差異。不同倍性藍(lán)靛果葉片的葉色值存在顯著差異，倍性越大，葉色值越大，綠色越濃郁，組培苗和大田苗趨勢(shì)一致。藍(lán)靛果葉片氮素含量與倍性呈正相關(guān)，組培苗和大田苗趨勢(shì)一致。

關(guān)鍵詞? ?多倍體；藍(lán)靛果；花青素；葉綠素；維生素C

藍(lán)靛果是忍冬科忍冬屬多年生落葉小灌木漿果植物，又稱(chēng)山茄子、羊奶子、黑瞎子果等。其果實(shí)口感酸甜微澀，具有豐富的活性物質(zhì)，可作為釀酒原料、飲料制作原料、天然色素原料?；ㄆ?—6月，果熟期8—9月。藍(lán)靛果中含有10%～17%的干物質(zhì)（糖5%～10%，酸1.5%～4.5%），含有18種氨基酸，含量比多數(shù)常見(jiàn)水果高，還含有鐵、錳、鎂、鈣、鉀、鈉、磷、鋅等礦質(zhì)元素和5種維生素（維生素C、B1、B2、B6和維生素P），具有較高的藥用和保健功能。前人多項(xiàng)研究表明，藍(lán)靛果具有抗氧化、改善心肌氧供求、治療冠心病、降低體重、降血脂、抗疲勞、保護(hù)肝組織等功效，還能加工制成果酒、果醬、果汁等，也可作為園林綠化和觀賞樹(shù)種。

目前我國(guó)的藍(lán)靛果多倍體研究主要采用秋水仙素誘導(dǎo)方式或倍體誘導(dǎo)方式獲得，我們對(duì)藍(lán)靛果葉片活性成分含量進(jìn)行測(cè)定分析，以期為早期篩選符合條件的多倍體、研究應(yīng)用多倍體藍(lán)靛果活性成分提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料? ?長(zhǎng)白山野生藍(lán)靛果中篩選出的優(yōu)良單株二倍體及其人工誘導(dǎo)的四倍體、八倍體藍(lán)靛果組培苗及1年生大田苗。

組培苗：采用繼代培養(yǎng)35天的組培苗1～2片頂葉；大田苗：采用7月中旬1年生大田苗充分展開(kāi)的頂葉1～2片。

試劑：丙醇、無(wú)水乙醇、鹽酸、乙醇、鉬酸銨、草酸、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸、冰乙酸、抗壞血酸、硫酸。

1.2? ?試驗(yàn)儀器及設(shè)備? ?分光光度計(jì)；冰箱；恒溫水浴鍋；離心機(jī)；研缽；試管；具塞三角瓶

1.3? ?試驗(yàn)方法

1.3.1? ?花青素、總酚、類(lèi)黃酮含量的測(cè)定? ?準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g葉片，剪成0.1 cm條狀，加入20? mL鹽酸（1.5 mmol/L）和95%乙醇（體積比15 ∶ 85）的混合液，置于暗處浸泡24小時(shí)，提取葉片中的花青素，按照王慶菊等的測(cè)定方法，按照以下公式可計(jì)算單位質(zhì)量葉片中花青素、類(lèi)黃酮和總酚的含量。

式中：

A：測(cè)定的吸光值

V：提取液體積（mL）

W：樣品重（g）

1.3.2? ?Vc含量的測(cè)定? ?參考植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的試驗(yàn)方法測(cè)定Vc含量。

1）溶液配制。①5%的鉬酸銨溶液：5 g鉬酸銨定容至100 mL；②草酸-EDTA溶液：分別稱(chēng)取草酸4.502 g、EDTA-Na2 0.75 g溶于蒸餾水，混合定容至1 L；③硫酸：按照1 ∶ 19比例配置所需的量；④偏磷酸-乙酸溶液：取片狀或新粉碎的棒狀片磷酸3 g，加1 ∶ 5冰乙酸40? mL溶解后，加水定容至100 mL，此試劑在冰箱中可保存3天，現(xiàn)用現(xiàn)配效果最佳；⑤1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)維生素C溶液：精確稱(chēng)取抗壞血酸100 mg，適量草酸-EDTA溶液溶解，定容至100 mL搖勻備用，標(biāo)準(zhǔn)品溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。吸取標(biāo)準(zhǔn)維生素C溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL，于具塞刻度試管中，加入溶液②定容至5 mL后，依次加入0.5 mL溶液④，1 mL溶液③，搖勻后再加2 mL溶液①，加水稀釋定容至15 mL，搖勻。于30 ℃水浴中放置15分鐘。以未加標(biāo)準(zhǔn)維生素C試管調(diào)零，在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)光 密度。

3）樣品中維生素C含量的測(cè)定。精確稱(chēng)取樣品1 g置于研缽中，加少量溶液②，研磨至勻漿，放入錐形瓶中，加溶液②定容至10 mL，振蕩30分鐘，放置30分鐘。倒入離心管中配平后，以4 000 rpm/分鐘離心15分鐘。取上清液1 mL于刻度試管中，加溶液②定容至5 mL，依次加入0.5 mL溶液④，1 mL溶液③，搖勻后再加2 mL溶液①，加水稀釋定容至15 mL，搖勻。于30 ℃水浴中放置15分鐘，上清液即為待測(cè)樣液，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度。

4）結(jié)果計(jì)算。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出維生素C毫克數(shù)，然后按下式計(jì)算樣品中的維生素C含量：

維生素C含量（mg/g）=（C×Vt）/（W×Vm）

式中：

C：測(cè)定液中維生素C毫克數(shù)（mg）

Vt：提取液總體積（mL）

Vm：測(cè)定液體積（mL）

W：樣品重（g）

1.3.3? ?葉綠素含量的測(cè)定? ?精確稱(chēng)取0.1 g葉片，加入10 mL丙酮和無(wú)水乙醇（體積比1 ∶ 2）的混合溶液，室溫避光浸提24小時(shí)，將提取溶液過(guò)濾并置于光徑為1 cm的比色皿中，以丙酮與無(wú)水乙醇混合溶劑作對(duì)照，用可見(jiàn)分 光光度計(jì)中測(cè)定吸光度，再根據(jù)提取溶液在645 nm和663 nm處的吸光度，由Amon公? 式算葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb）和總?cè)~綠素? ? 含量。

式中：

Ca、Cb：葉綠素a、b含量（mg/g）

A663、A645：663 nm、645 nm測(cè)定的吸光值

V：測(cè)定液體積（mL）

W：樣品重（g）

1.3.4? ?葉片氮素及葉色值的測(cè)定? ?利用植株養(yǎng)分速測(cè)儀（TYS-3N）對(duì)藍(lán)靛果葉片中氮素含量及葉色值進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的葉片采用正常生長(zhǎng)且沒(méi)有蟲(chóng)食的健康葉片，每個(gè)株系測(cè)定20個(gè)葉片，對(duì)每個(gè)葉片不同位置測(cè)10次，最后結(jié)果取平均值。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?藍(lán)靛果倍性與花青素、總酚、類(lèi)黃酮含量、維生素C的關(guān)系

由表1可知，二倍體、四倍體、八倍體大田苗與組培苗葉片中花青素、類(lèi)黃酮、總酚含量3個(gè)指標(biāo)不同倍性間差異顯著；大田苗葉片中維生素C的含量是隨著倍性增加逐漸降低，二倍體和四倍體顯著高于八倍體，二倍體和四倍體之間沒(méi)有顯著差異；組培苗中同樣是隨著倍性增加下降的趨勢(shì)，二倍體顯著高于八倍體，二倍體和四倍體、四倍體和八倍體之間均有差異但不顯著。

2.2? ?藍(lán)靛果倍性與葉綠素的關(guān)系

由表2可知，八倍體的Ca和Cb的含量與二倍體之間存在顯著差異，四倍體和二倍體與四倍體和八倍體均是有差異但不顯著；不同倍性藍(lán)靛果大田苗總?cè)~綠素含量存在顯著差異，八倍體顯著高于四倍體和二倍體，四倍體顯著高于二倍體；藍(lán)靛果大田苗三種倍性葉片中的總?cè)~綠素均高于相對(duì)應(yīng)倍性組培苗中的含量；葉綠素a和葉綠素b比值隨著倍性升高而降低，八倍體和四倍體、四倍體和二倍體均存在差異，但差異不顯著。以上四個(gè)指標(biāo)組培苗與大田苗變化趨勢(shì)一致。

2.3? ?藍(lán)靛果倍性與葉色值和氮素的關(guān)系

由表3可知，三種倍性藍(lán)靛大田苗果葉色值隨倍性升高而升高，不同倍性間差異顯著，組培苗和大田苗變化趨勢(shì)一致；八倍體大田苗氮素顯著高于二倍體，大田苗氮素含量四倍體和八倍體、四倍體和二倍體之間均有差異但不顯著，組培苗氮素含量與大田苗變化趨勢(shì)? ? 一致。

3? ?結(jié)論

采用不同倍性藍(lán)靛果組培苗和大田苗葉片為試驗(yàn)材料，探討不同倍性藍(lán)靛果組培苗和大田苗葉片活性成分含量，著重對(duì)葉綠素、花青素、總酚、類(lèi)黃酮、維生素C進(jìn)行分析，為早? ?期預(yù)測(cè)品種是否符合多倍體特征提供了參考 依據(jù)。

前人研究表明，藍(lán)靛果不同組織部位活性成分含量有所不同。因此，可以在接下來(lái)的試驗(yàn)中對(duì)不同倍性藍(lán)靛果的果實(shí)進(jìn)行活性成分測(cè)定，通過(guò)數(shù)據(jù)的對(duì)比分析了解活性成分含量的分布以及隨倍性改變果實(shí)活性含量變化，以便為后續(xù)研究利用提供參考。

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