甘藍黑斑病病原菌鑒定及其對殺菌劑的敏感性

劉志剛, 余方偉, 張 偉, 于 利, 李建斌, 王神云, 宋江華

(1.安徽農業大學園藝學院,安徽 合肥 230036; 2.江蘇省農業科學院蔬菜研究所,江蘇 南京 210014)

十字花科蕓薹屬植物(Brassicaspp.)包含甘藍(Brassicaoleraceavar.capitataL.)、白菜(Brassicarapa)和油菜(Brassicanapus)等多種蔬菜油料作物,在全球種植的農作物中占有重要地位。2019年,甘藍及其他蕓薹屬作物的栽培面積位列中國蔬菜種植面積前十,同時該類作物的出口量達9.853×104t,在中國蔬菜主要出口種類中位列第2[1]。江蘇省是甘藍的重要種植區之一[2],近年來,隨著甘藍栽培面積逐漸擴大,黑斑病頻頻發生,成為影響甘藍可持續生產的重要病害。

十字花科作物黑斑病由鏈格孢屬真菌(Alternariaspp.)引起,可危害植物的葉片、莖、葉柄、角果等組織。葉面發病時,侵染部位產生水漬狀小點,并逐漸形成許多肉眼可見的小黑點,后期發展成同心輪紋病斑,病斑有時穿孔[3]。世界范圍內,黑斑病導致印度十字花科油料作物產量損失15%～71%,在加拿大,因黑斑病導致的十字花科油料作物產量損失達20%～30%[4]。除了導致作物減產外,鏈格孢屬真菌還會產生70多種真菌毒素,其中交鏈孢酚單甲醚(Alternariol 9-monomethyl ether)具有基因毒性、交鏈孢毒素(Altertoxin)具有致突變性,是人類健康的潛在威脅[5-6]。

鏈格孢屬真菌種類多且分類復雜,目前已有記錄的就有300多種[7]。為了明確甘藍黑斑病病原菌的分類地位,王超等[8]通過核糖體DNA內轉錄間隔區(rDNA-ITS)序列分析發現,蕓薹生鏈格孢(Alternariabrassicicola)是引起東北農業大學實習基地內甘藍黑斑病的病原菌。另有研究結果表明,蕓薹生鏈格孢、蕓薹鏈格孢(Alternariabrassicae)、蘿卜鏈格孢(Alternariaraphani)、鏈格孢(Alternariaalternata)均能侵染甘藍[3]。為了揭示江蘇省甘藍黑斑病的病原菌種類,從江蘇省南京市和宜興市采集疑似黑斑病的甘藍病株,在明確分離菌株形態學特征和致病性的基礎上,結合多基因分子系統學研究,鑒定甘藍黑斑病致病菌,同時測試不同殺菌劑對病原菌的室內毒力,以期為甘藍黑斑病病原菌的鑒別和防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病樣采集與病原菌分離

在南京市江寧區和宜興市周鐵鎮甘藍種植區,選取具有黑斑病發病典型癥狀的甘藍植株,拍照并采集病葉備用。按照方中達[9]的常規組織分離方法進行甘藍黑斑病病原菌分離,從病變葉片邊緣切下5 mm×5 mm大小的葉片組織,75%乙醇表面消毒90 s,無菌水洗凈后用滅菌濾紙吸干水分,接種于PDA培養基(貨號CM0139,Oxoid公司產品),置于25 ℃條件下培養。長出的菌落經過單孢純化,保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 形態特征觀察

用打孔器在菌落邊緣取直徑為0.5 cm的菌絲塊,接種到PDA平板中央,置于25 ℃培養7 d,然后觀察菌落形態。用無菌水洗脫分生孢子,在光學顯微鏡(貨號Olympus CX33,Olympus公司產品)下觀察分生孢子形態特征。

1.3 致病性測定

用于病原菌致病性測試的甘藍品種HBJD283由江蘇省農業科學院蔬菜研究所提供。將甘藍種子播種在含基質的50穴育苗盤中,于溫室中培養約30 d后備用。

菌絲塊接種法:供試菌株在25 ℃培養7 d,然后用打孔器在菌落邊緣取直徑為0.5 cm的菌絲塊,將菌絲塊接種于離體甘藍葉片表面,以接種瓊脂塊的葉片作為對照。接種后的葉片置于托盤內,覆蓋保鮮膜保濕,在25 ℃條件下培養3 d,然后觀察發病情況。

孢子噴霧法:將供試菌株接種至PDA培養基中,置于25 ℃條件下培養7～10 d,收集分生孢子,使用無菌水調整分生孢子懸浮液中分子孢子含量為1 ml 1×105個。通過噴霧法將孢子懸浮液噴灑在離體甘藍葉片上,以噴灑無菌水的葉片作為對照。接種后的葉片置于托盤內,覆蓋保鮮膜保濕,在25 ℃條件下培養3 d,然后觀察發病情況。

1.4 分子生物學鑒定

用滅菌牙簽從25 ℃培養10 d左右的PDA平板上刮取菌絲,根據Cenis[10]報道的方法提取菌株基因組DNA。利用目的基因引物對供試菌株的rDNA-ITS、過敏原基因(Alta1)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)進行PCR擴增(表1)。PCR擴增體系(50 μl):25 μl 2×QuickTaq? HS DyeMix(DTM-101,Toyobo),1 μl基因組DNA,上下游引物各2 μl,20 μl ddH2O。擴增程序,rDNA-ITS:95 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,30個循環;最后72 ℃ 7 min。Alta1基因:95 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 min,57 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,30個循環;最后72 ℃ 10 min。GAPDH基因:95 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環;最后72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送通用生物(安徽)股份有限公司進行雙向測序。獲得的目的片段序列經校對后,在NCBI網站進行BLAST檢索分析。下載蕓薹生鏈格孢、其他鏈格孢屬成員及番茄匍柄霉的目的基因序列,采用MEGA 7.0軟件構建多基因系統發育樹。

表1 擴增目的基因所用引物

1.5 病原菌對殺菌劑敏感性測定

采用菌絲生長抑制試驗測定病原菌對不同化學藥劑的敏感性。供試藥劑如下:25%苯醚甲環唑用乳油(EC)稀釋(終質量濃度分別為1.000 0 μg/ml、0.500 0 μg/ml、0.250 0 μg/ml、0.125 0 μg/ml、0.062 5 μg/ml);25%丙環唑用乳油(EC)稀釋(終質量濃度分別為1.000 0 μg/ml、0.500 0 μg/ml、0.250 0 μg/ml、0.125 0 μg/ml、0.062 5 μg/ml);50%異菌脲用可濕性粉劑(WP)稀釋(終質量濃度分別為2.000 μg/ml、1.000 μg/ml、0.500 μg/ml、0.250 μg/ml、0.125 μg/ml);80%代森錳鋅用可濕性粉劑(WP)稀釋(終質量濃度分別為200.0 μg/ml、100.0 μg/ml、50.0 μg/ml、25.0 μg/ml、12.5 μg/ml);40%氟硅唑用乳油(EC)稀釋(終質量濃度分別為1.000 0 μg/ml、0.500 0 μg/ml、0.250 0 μg/ml、0.125 0 μg/ml、0.062 5 μg/ml);50%咯菌腈用可濕性粉劑(WP)稀釋(終質量濃度分別為1.000 0 μg/ml、0.500 0 μg/ml、0.250 0 μg/ml、0.125 0 μg/ml、0.062 5 μg/ml);45%戊唑醇用懸浮劑(SC)稀釋(終質量濃度分別為1.000 0 μg/ml、0.500 0 μg/ml、0.250 0 μg/ml、0.125 0 μg/ml、0.062 5 μg/ml);40%己唑醇用懸浮劑(SC)稀釋(終質量濃度分別為1.000 0 μg/ml、0.500 0 μg/ml、0.250 0 μg/ml、0.125 0 μg/ml、0.062 5 μg/ml)。

菌絲生長抑制測定:將直徑為0.5 cm的菌塊分別接種到含殺菌劑PDA平板和不含殺菌劑但含等量稀釋溶劑的PDA平板(對照)上。每個處理重復4次。接種后的PDA平板置于25 ℃恒溫培養箱中培養7 d,然后以十字交叉法測量各處理的菌落直徑,求出菌落直徑平均值,并計算抑制率。菌絲生長抑制率=(對照菌絲生長直徑-不同殺菌劑下的菌絲生長直徑)/(對照菌絲生長直徑-0.5 cm)×100%。

使用SPSS Statistics 20,對以10為底數的殺菌劑質量濃度的對數值(x)和對應的菌絲生長抑制率(Y)進行回歸分析,求出毒力回歸方程(Y=ax+b)和有效抑制中濃度(EC50)。

2 結果與分析

2.1 甘藍黑斑病田間典型癥狀

田間調查發現,甘藍植株下部葉片發病最為頻繁,同時葉球部分也有發病。發病初期形成圓形褪綠斑,隨著病情進一步發展,病斑逐漸擴大變黑,四周伴有黃色暈圈,后期病斑轉為淡褐色且帶有同心輪紋,濕度高時可見黑褐色霉狀菌絲,病斑部分有時破裂或穿孔,嚴重時病斑匯集成塊,葉片大面積枯死,全株葉片由外向內干枯(圖1)。

圖1 甘藍黑斑病田間癥狀Fig.1 Symptoms of cabbage black spot in the field

2.2 病原菌分離

采用組織分離法對甘藍病葉進行病原分離和純化,共得到6個菌株,利用顯微鏡觀察菌絲產孢形態及孢子形態(圖2)。6個菌株菌落形態和分生孢子形態的具體描述見表2。HB1、HB3、HB6菌落和分生孢子形態相似但孢子大小略有差異,其他3個菌株的菌落和分生孢子形態差異明顯。

圖2 分離獲得的6個病原菌的形態學特征Fig.2 Morphological characteristics of six pathogens

表2 6個病原菌菌株的形態學比較

2.3 病原菌的致病性

參照科赫氏法則測試分離病原菌的致病性。通過菌絲塊法及孢子噴霧法接種甘藍離體葉片發現,在分離的菌株中,僅有HB1、HB3、HB6能在甘藍葉片上致病(圖3)。與對照相比,接種上述3個菌株菌絲塊的葉片黃化嚴重,有時可見霉層,且病斑部分易破裂(圖3);通過噴霧法接種孢子3 d后,葉片表面密布水漬狀小病斑,病斑周圍黃化,與田間甘藍黑斑病初期癥狀一致(圖3)。

圖3 分離獲得的甘藍黑斑病病原菌的致病性Fig.3 Pathogenicity of the pathogens causing cabbage black spot

2.4 分子生物學鑒定及序列分析

在形態學初步鑒定的基礎上,結合分子鑒定技術進一步明確分離得到的黑斑病病原菌的分類地位。基于形態學鑒定及致病性測定,確定HB1、HB3、HB6為病原菌,以HB1、HB3、HB6的基因組DNA為模板,分別擴增rDNA-ITS、Alta1、GAPDH基因,經測序獲得rDNA-ITS長度分別為578 bp、587 bp、587 bp,Alta1長度分別為516 bp、511 bp、518 bp,GAPDH長度分別為595 bp、595 bp、596 bp的目的片段。將3個菌株的目的片段序列在NCBI網站進行BLAST檢索分析,結果顯示供試菌株的目的片段與蕓薹生鏈格孢菌株具有很高的序列相似性(99.63%～100.00%)。下載蕓薹生鏈格孢及其他鏈格孢屬成員的目的基因序列(表3),按照首尾相連方法將上述序列拼接后進行分析。以番茄匍柄霉為外群,采用MEGA7.0軟件中的最大似然法(Maximum likelihood)構建多基因系統發育樹,以Bootstrap進行1 000次重復檢驗,估算分支的自展支持率,分析供試菌株與其近緣種菌株的親緣關系,確定其分類地位。如圖4所示,本研究中獲得的3個菌株與蕓薹生鏈格孢的2個參考菌株緊密聚類在一起,自展支持率為100%。綜合致病性測定結果以及病原菌形態特征,結合多基因序列聯合分析,最終確定分離得到的甘藍黑斑病病原菌為蕓薹生鏈格孢。

節點處僅顯示大于50%的自展支持率,黑色圓圈標示處為供試菌株。圖4 基于rDNA-ITS、Alt a1、GAPDH的多序列聯合聚類分析Fig.4 Phylogenetic analysis based on rDNA-ITS, Alt a1, GAPDH

表3 聚類分析所用的參考菌株及其目的基因和核糖體DNA內轉錄間隔區(rDNA-ITS) GenBank登錄號

2.5 病原菌對殺菌劑的敏感性

采用菌絲生長抑制法測試8種殺菌劑對供試菌株HB1的毒力。結果顯示,苯醚甲環唑、咯菌腈、己唑醇、氟硅唑、戊唑醇、丙環唑、異菌脲對供試菌株的抑制效果較好,EC50分別為0.037 μg/ml、0.039 μg/ml、0.064 μg/ml、0.134 μg/ml、0.175 μg/ml、0.263 μg/ml、0.641 μg/ml,對供試菌株的抑制效果最弱的藥劑為代森錳鋅,其EC50為280.101 μg/ml(表4)。

3 討 論

鏈格孢屬真菌種類多且分類復雜[14-17],目前已有記錄的就有300多種[7],隨著高通量測序技術的快速發展,越來越多的真菌基因組相繼被報道,這也為多序列聯合分析提供了極大便利。基于168個鏈格孢屬真菌菌株的Alta1、GAPDH、內聚半乳糖醛酸酶基因(endoPG)、rDNA-ITS、翻譯延伸因子1-alpha基因(TEF1)、RNA聚合酶II亞基基因(RPB2)和一個匿名基因區域OPA10-2的序列,Woudenberg等[18]構建了鏈格孢屬真菌系統發育樹。在其他植物黑斑病的病原菌鑒定方面,研究人員在rDNA-ITS的基礎上,聯用Alta1、三磷酸腺苷酶基因(ATPase)、鈣調蛋白基因(CAL)、GAPDH、RPB2、TEF1中的部分基因,明確了大麻黑斑病[19]、香蕉黑斑病[20]、甜瓜黑斑病[21]的病原菌。本研究通過rDNA-ITS、Alta1、GAPDH序列聯合分析發現,致病菌株HB1、HB3、HB6與2個蕓薹生鏈格孢參考菌株緊密聚在一起,綜合致病性測定結果以及病原菌形態特征,確定從甘藍病葉中分離到的黑斑病病原菌為蕓薹生鏈格孢。鑒于引起十字花科黑斑病的鏈格孢屬真菌的種群組成復雜[22],后續將進一步對江蘇省其他地區的甘藍黑斑病病樣進行病原菌分離鑒定,借以探明江蘇省甘藍黑斑病的致病菌組成。

如何有效防治鏈格孢屬真菌引起的黑斑病是當前蔬菜生產上面臨的難題,目前十字花科蕓薹屬栽培種中缺乏高抗黑斑病的材料,只在亞麻薺(Camelinasativa)、薺菜(Capsellabursa-pastoris)等其他十字花科植物中發現了一些抗性較好的種質資源[23]。化學防治仍然是目前十字花科作物黑斑病防控的重要手段。本研究結果表明,苯醚甲環唑、咯菌腈、己唑醇、氟硅唑、戊唑醇、丙環唑、異菌脲對甘藍黑斑病病原菌的抑制作用較強。前人研究結果表明,丙環唑、苯醚甲環唑、己唑醇對引起秋葵黑斑病的鏈格孢具有較好的抑制效果[24];咪鮮胺、異菌脲、戊唑醇對引起核桃黑斑病的鏈格孢有較好抑制作用[25];戊唑醇和苯醚甲環唑這兩種三唑類藥劑對白菜黑斑病的蕓薹鏈格孢的抑制效果較好[26];苯醚甲環唑對三七黑斑病病原菌(Alternariapanax)的菌絲生長抑制效果明顯[27];丙環唑對導致芥菜黑斑病的蕓薹鏈格孢的抑制效果較好[28];咯菌腈和異菌脲對引起月季黑斑病的鏈格孢的抑制作用較強[29]。從以上研究結果可以看出,在測試的化學藥劑中,苯醚甲環唑和戊唑醇為代表的三唑類、咯菌腈為代表的苯基吡咯類、異菌脲為代表的二甲酰亞胺類殺菌劑對黑斑病病原菌的菌絲生長抑制效果總體較好。但也有報道,異菌脲對三七黑斑病病原菌的菌絲生長抑制效果較差[27];戊唑醇和異菌脲對引起芍藥黑斑病的鏈格孢的抑制作用較差[30]。因此,針對鏈格孢屬真菌引起的不同植物的黑斑病,需要篩選和匹配合適的殺菌劑,才能達到較好防治效果。由于本研究篩選的藥劑主要來自室內毒力測定試驗結果,后續需要室外試驗來進一步檢驗。