鹽酸丙卡特羅片溶出度測定方法的建立及與原研片一致性評價

劉珊珊，何承華，王 松，吳瓊珠

1江蘇經貿職業技術學院 健康學院，南京 211168；2南京艾德加生物制藥科技有限公司，南京 210033；3中國藥科大學 藥學院，南京 211198

鹽酸丙卡特羅是第3 代高度選擇性β2受體激動劑類支氣管擴張藥，由日本大冢制藥株式會社于1980 年研制成功并上市，規格為25 μg，臨床主要用于治療支氣管哮喘、喘息性支氣管炎、肺氣腫等[1]。因鹽酸丙卡特羅分子結構上有兩個手性碳原子及酚羥基、仲胺基兩個活潑基團，極易異構化成蘇式異構體（雜質A）和氧化成5-甲酰基-8-羥基喹諾酮（雜質C），還可能含有合成起始原料8-羥基喹諾酮（雜質B）[2，3]（圖1）。此外，對于痕量藥物的固體制劑來說，其溶出度測定方法的建立與測定是質量研究工作的難點之一，日本橙皮書[4]和中國藥典（ChP）[5]雖有收載，但兩者差異較大。仿制藥與原研藥的質量差異主要通過體外模擬口服固體制劑在胃腸道的溶出以評價其內在質量，而多種溶出介質中測定的溶出曲線可有效反映藥物在體內的釋放過程[6，7]。本研究比較了鹽酸丙卡特羅仿制片與原研片在5 種不同溶出介質中的溶出曲線，為國內鹽酸丙卡特羅片仿制藥一致性評價及處方工藝篩選提供一定的參考。

圖1 鹽酸丙卡特羅及其雜質的化學結構

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

RC12AD 溶出試驗儀及ZKT-18F 真空脫氣儀購自天津市天大天發科技有限公司，Thermo U3000高效液相色譜儀購自美國賽默飛公司，MSE6.6S-0CE-DM 微量天平和BT125D 電子天平購自德國賽多利斯公司，FE-28 pH 計購自瑞士梅特勒公司。

1.2 藥品與試劑

原研鹽酸丙卡特羅片（日本大冢制藥株式會社，批號8G92M1，9C95M1，0C95M1），仿制鹽酸丙卡特羅片（安徽環球藥業股份有限公司，批號20201101、20201102、20201103），鹽酸丙卡特羅對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100275-201903，純度96.7%），雜質A 對照品（南京天海醫藥科技有限公司，批號190302，純度97.69%），雜質B 對照品[阿拉丁試劑（上海）有限公司，批號E1705027，純度99.96%]，雜質C 對照品（Cato Research Chemicals，批號C4X-150013-1612，純度99.4%）。

甲醇（色譜純，美國天地有限公司），其它試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Thermo Hypersil GOLD（4.6 mm ×150 mm，5 μm），流動相為磷酸鹽緩沖液（取NaH2PO411.04 g，加水適量溶解，磷酸調節pH 值至3.10 后加水至1000 mL）-甲醇（83∶17），檢測波長為259 nm，柱溫為35℃，流速為1.0 mL·min-1，進樣量為100 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白輔料溶液 按處方比例配制空白輔料，混合均勻，精密稱取60 mg 空白輔料置1000 mL 量瓶中，加入溶出介質適量，振搖使分散并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為空白輔料溶液。

2.2.2 對照品溶液 稱取鹽酸丙卡特羅對照品約6 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為60 μg·mL-1的儲備液。精密量取該儲備液，加溶出介質定量稀釋成濃度為0.025 μg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 雜質對照品溶液 分別稱取雜質A、B、C 對照品各3 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為30 μg·mL-1的各雜質儲備液。分別量取鹽酸丙卡特羅、雜質A、B、C儲備液，加溶出介質定量稀釋成鹽酸丙卡特羅濃度為6 μg·mL-1、雜質A、B、C 濃度分別為0.12 μg·mL-1的溶液，作為各單個成分對照品溶液，再依法配制同濃度的主成分-雜質混合溶液。

2.2.4 供試品溶液 取樣品12 片，加溶出介質900 mL，采用漿板法，轉速為50 r·min-1，依法操作，15min 時，取溶出液20mL，用0.45μm 微孔濾膜濾過，至少棄去初濾液10 mL，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 溶出條件的選擇

日本橙皮書收載的鹽酸丙卡特羅片（規格25μg）的溶出曲線數據是以900 mL 4 種溶出介質（水、pH 1.2 鹽酸溶液、pH 4.0 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液，分別記為A～D），采用槳法（50 r·min-1）進行，而ChP 現行標準則采用100 mL 鹽酸溶液（3→50 000，記為E）作為溶出介質，采用小杯法（70 r·min-1）進行（具體條件見表1）。根據《普通口服固體制劑溶出度試驗技術指導原則》[8]和相關文獻[9，10]，鹽酸丙卡特羅片的溶出條件設定為：溶出介質為日本橙皮書收載的4 種介質以及ChP 收載的1 種介質，體積900 mL，溫度（37±0.5）℃，漿法，轉速50 r·min-1，上述5 種介質均采用脫氣裝置經42℃脫氣1 h后立即使用，取樣時間為5、10、15 min。

表1 鹽酸丙卡特羅片溶出度測定方法比較

2.4 溶出度測定方法的建立與驗證

2.4.1 專屬性 分別量取“2.2”項下的空白輔料溶液、主成分及雜質A、B、C 單個對照品溶液及主成分-雜質混合溶液各100 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各成分色譜峰保留時間及分離度見表2。結果說明3 個已知雜質均與主成分達到基線分離，且空白輔料不干擾測定。

表2 各雜質峰保留時間及分離度

2.4.2 方法耐用性 微調色譜條件，改變因素包括流動相比例±1、pH 變化±0.2、流速變化±0.2、柱溫變化±5℃。以主成分-雜質混合溶液作為耐用性試驗溶液，考察條件改變對測定結果的影響。結果發現各雜質與主成分之間分離度均良好，測得丙卡特羅、雜質A、B、C 峰面積的RSD 分別為1.63%、2.45%、1.21%和2.09%，表明方法耐用性良好。

2.4.3 線性與范圍 分別精密量取“2.2”項下的鹽酸丙卡特羅儲備液1 mL 置100 mL 量瓶中，用5 種不同溶出介質稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.6 μg·mL-1的各溶出介質標準儲備液。分別量取各溶出介質標準儲備液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 置25 mL量瓶中，用各自溶出介質稀釋至刻度，搖勻，制成系列標準溶液。依法進樣測定，以峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得標準曲線和相關系數（表3），說明對照品溶液在0.009 6～0.033 6 μg·mL-1的濃度范圍內與峰面積線性關系良好。

表3 5 種溶出介質標準曲線、范圍及相關系數

2.4.4 精密度 取上述各標準曲線中濃度為0.028 8 μg·mL-1溶液，連續進樣6 次，記錄峰面積并計算RSD，結果其RSD 均小于2.0%，說明精密度良好。另取仿制片（20201101）1 片，置溶出杯中，加不同溶出介質依法操作，經15 min 取樣，連續進樣6次，計算平均溶出度和RSD，結果其RSD 均小于2%，說明重復性良好。

2.4.5 溶液穩定性 取“2.4.4”項下的供試品溶液，除pH 1.2 供試品溶液在冰箱低溫4℃放置，其余4種介質分別在室溫放置0、1、3、5、7、9、11、13，15 h，依法進樣測定，結果發現丙卡特羅的峰面積幾無變化，其RSD 均＜2.0%，說明各介質穩定性良好。

2.4.6 準確度 精密量取“2.2”項下對照品儲備溶液適量，加空白輔料溶液定量稀釋成相當于片中含量的80%、100%、120%三種濃度共9 個樣品，依法進樣測定，計算加樣回收率。結果在5 種介質中的加樣回收率均在95.0%～105.0%之間，RSD 均＜2.5%。

2.4.7 濾膜吸附性 取仿制片（20201101）10 片，研成細粉，取細粉60 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，分別加入5 種溶出介質適量，振搖10 min，定容后稀釋10 倍，作為供試品溶液。取該供試品溶液以13000r·min-1離心5 min，取上清液作為離心溶液。另取供試品溶液用該濾膜過濾，分別棄去5、10、15 mL 后，依法進樣測定，以續濾液與離心液峰面積比值計算回收率，結果5 種溶出介質的續濾液回收率均在97.0%～103.0%之間，表明使用該濾膜過濾對丙卡特羅基本無吸附作用。

2.5 樣品溶出度測定

仿制與原研鹽酸丙卡特羅片分別按表1 方法進行檢查，結果均符合規定，且3 種方法測定結果無顯著差異（表4）。

表4 不同溶出度測定方法溶出度測定結果比較（n=12，%）

2.6 溶出曲線相似性評價

取1 批原研片（8G92M1）與3 批仿制片（20201101、20201102、20201103）各12 片，按新建方法在第5、10 和15 min 時間點各取樣20 mL，并及時補充溶出介質20 mL，0.45 μm 微孔濾膜濾過，棄去至少10 mL，除水作為溶出介質時取續濾液9 mL置10 mL 量瓶中，加0.228%磷酸溶液稀釋至刻度進行酸化外，其余4 種介質均取續濾液作為供試品溶液，依法進樣測定（pH 1.2 溶出介質供試品溶液進樣盤溫度控制在4℃），按外標法以峰面積計算各時間點的累積溶出百分量并繪制溶出曲線（圖2）。結果發現，3 批仿制片及1 批原研片在5 種不同介質中15 min 時累積溶出量均大于85%，根據《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》可直接判定二者溶出行為相似[11]。

圖2 3 批仿制及1 批原研鹽酸丙卡特羅片在水（A）、pH 1.2（B）、pH 4.0（C）、pH 6.8（D）、pH 3.0（E）中的溶出曲線（n=12）

3 討論

3.1 溶出度測定方法

ChP 現行標準采用小杯法，轉速較高（70 r·min-1），10 min 時溶出限度為90%。小杯法在國際上一般很少采用，具有一定的局限性，且鹽酸丙卡特羅為生物藥劑學分類系統Ⅲ類，屬于高溶解、低滲透性藥物，無pH 依賴性，原研片在5 種不同介質、轉速50 r·min-1條件下15 min 時的溶出量均達85%以上，屬于快速溶出制劑，因此參照日本橙皮書選擇第二法即槳法，轉速50 r·min-1。

3.2 溶出介質考察

實驗中發現鹽酸丙卡特羅在水中極不穩定，不銹鋼取樣針中微量的鐵銹或棕色玻璃進樣瓶中的含鐵染料均可能導致測定結果異常，且日本橙皮書中供試品溶液需用磷酸溶液酸化使其穩定，操作繁瑣，故不建議用水作為溶出介質。而常用的pH 1.2 的鹽酸溶液酸性太強，室溫放置時間過長也會因鹽酸丙卡特羅降解而導致測定結果差異，需要冰箱冷藏或控制進樣盤溫度（4℃），因此可選擇鹽酸溶液（3→50 000）、pH 4.0 和pH 6.8 三種介質作為多條溶出曲線評價一致性時的溶出介質，而pH 6.8 介質穩定且區分能力相對較大，可作為篩選處方工藝的溶出介質。考慮到鹽酸丙卡特羅片為快速溶出制劑，建議其溶出介質仍為鹽酸溶液（3→50 000），限度為85%。

3.3 色譜條件

日本橙皮書收載的色譜條件，其流動相中加入離子對試劑戊烷磺酸鈉和醋酸，離子對試劑費用高而醋酸易揮發，可能導致不穩定，因此選用ChP 收載方法中的色譜條件。