信號(hào)在冬小麥根系細(xì)胞中的產(chǎn)生及傳導(dǎo)機(jī)理

祁偉亮,孟建軍,張 成,劉自成,施萬喜,楊 虓,喬 巖,楊財(cái)容,喬義林,李金玲,陳思偉,姚來來,賴守孝,張 鵬,劉文輝,王 婧,袁蘭蘭

(1.隴東學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院,甘肅慶陽 745000;2.隴東旱地作物種質(zhì)改良及產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心,甘肅慶陽 745000;3.甘肅省旱地冬小麥種質(zhì)創(chuàng)新與應(yīng)用工程研究中心,甘肅慶陽 745000; 4.成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,特色園藝生物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611130)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料有品種‘隴育5號(hào)’‘隴育8號(hào)’‘隴育10號(hào)’及品系‘隴育5-2’,源于隴東學(xué)院小麥研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 冬小麥遺傳背景分析 為進(jìn)一步明確冬小麥品種‘隴育5號(hào)’‘隴育8號(hào)’‘隴育10號(hào)’及品系‘隴育5-2’的遺傳背景,染色體制片按照Qi等[14]的方法進(jìn)行。首先將制備好的片子進(jìn)行熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)分析,選用探針pSc119.2(綠色)和pTa535(紅色)檢測冬小麥品種‘隴育5號(hào)’‘隴育8號(hào)’‘隴育10號(hào)’及品系‘隴育5-2’的A、B、D染色體組。探針pSc119.2主要區(qū)分小麥B基因組,探針pTa535主要識(shí)別小麥A、B、D基因組[15]。探針pSc119.2和pTa535由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,雜交程序參照Fu等[16]和Qi等[14]的方法配置10 μL雜交液體系:pSc119.2(0.3 μL)+pTa535(0.3 μL)+9.4 μL(2 × SSC和 1×TE)緩沖液瞬時(shí)離心混合。每張載玻片上滴加10 μL探針工作液,置于37 ℃恒溫水浴鍋中雜交2 h,雜交完后用2×SSC溶液清洗,晾干后向每張載玻片上滴加10 μL DAPI復(fù)染液,黑暗環(huán)境下放置10 min后,然后用熒光顯微鏡(Olympus BX-51)采集照片。

1.2.2 ROS信號(hào)組織檢測 挑選籽粒飽滿的冬小麥種子,清洗干凈、吸干、低溫(4 ℃)春化12 h,以打破種子休眠。將冬小麥品種‘隴育5號(hào)’‘隴育8號(hào)’‘隴育10號(hào)’及品系‘隴育5-2’分別進(jìn)行正常處理(25 ℃)、DPI+正常處理(25 ℃)、冷脅迫 (4 ℃)和DPI+冷脅迫(4 ℃)抑制處理。

正常處理(25 ℃)和DPI+正常處理(25 ℃):將冬小麥品種‘隴育5號(hào)’‘隴育8號(hào)’‘隴育10號(hào)’及品系‘隴育5-2’在正常處理(25 ℃)和 DPI+正常處理(25 ℃)條件下培養(yǎng)2 d,培養(yǎng)條件為晝夜溫度(25 ℃),光/暗周期(14 h/10 h),光照度(6 000 lx)。因DPI+正常處理(25 ℃)后種子未發(fā)芽,對正常處理(25 ℃)1 d和2 d的材料進(jìn)行ROS組織染色,染色方法參照 Kumar等[17]的方法,首先將氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)1%溶液倒入培養(yǎng)瓶,淹沒種子并避光侵染8 h。其后將材料浸泡在無水乙醇中。最后用甘油浸制并固定試驗(yàn)材料并在正置熒光顯微鏡(BA410E)下拍照。DPI(317.92 μmol/L)稱取10 mg二苯基氯化碘鹽,以少許二甲亞砜溶解,用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)定容至100 mL。

冷脅迫(4 ℃)處理和DPI+冷脅迫(4 ℃)抑制處理:為了明確冷脅迫處理后,冬小麥品種‘隴育5號(hào)’‘隴育8號(hào)’‘隴育10號(hào)’及品系‘隴育5-2’在冷脅迫(4 ℃)環(huán)境下的發(fā)芽率、根系和芽的生長情況及ROS信號(hào)在冬小麥組織細(xì)胞中的產(chǎn)生規(guī)律。首先將冬小麥品種‘隴育5號(hào)’‘隴育8號(hào)’‘隴育10號(hào)’及品系‘隴育5-2’在冷脅迫 (4 ℃)條件下培養(yǎng)7 d,培養(yǎng)條件為晝夜溫度 (4 ℃),光/暗周期(14 h/10 h),光照度(6 000 lx)。然后分別對培養(yǎng)7 d的材料進(jìn)行發(fā)芽率、根長和芽長測定,發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬小麥遺傳背景及種子發(fā)芽情況分析

為進(jìn)一步明確冬小麥品種‘隴育5號(hào)’‘隴育8號(hào)’‘隴育10號(hào)’及品系‘隴育5-2’的遺傳背景,以pSc119.2和pTa535為探針進(jìn)行遺傳背景分析,結(jié)果表明:‘隴育5號(hào)’(圖1-a)、‘隴育5-2’(圖1-b)、‘隴育8號(hào)’(圖1-c)和‘隴育10號(hào)’(圖1-d)等材料均屬于六倍體材料(2n=42),染色體組成為AABBDD基因組。

以pSc119.2(綠色)和pTa535(紅色)為探針對‘隴育5號(hào)’(a)、‘隴育5-2’(b)、‘隴育8號(hào)’(c)和‘隴育10號(hào)’(d)進(jìn)行鑒定

在正常(25 ℃)環(huán)境下‘隴育5號(hào)’‘隴育5-2’‘隴育8號(hào)’和‘隴育10號(hào)’的發(fā)芽率無顯著差異(P>0.05)且發(fā)芽率均在95%以上,這說明供試材料的種子生長活力較好。在4 ℃冷脅迫環(huán)境下培養(yǎng)7 d后,‘隴育5號(hào)’‘隴育5-2’‘隴育8號(hào)’和‘隴育10號(hào)’種子的發(fā)芽率分別為91.71%、 90.63%、72.45%和62.78%(表1),且冷脅迫 (4 ℃)環(huán)境下品系‘隴育5-2’和‘隴育5號(hào)’的長勢顯著好于‘隴育8號(hào)’和‘隴育10號(hào)’(圖2),其中‘隴育5號(hào)’的芽長為2.15 cm,顯著長于品系‘隴育5-2’,但品系‘隴育5-2’的根長為3.81 cm,顯著長于‘隴育5號(hào)’(表1),這說明‘隴育5-2’和‘隴育5號(hào)’在冷脅迫環(huán)境下的適應(yīng)能力存在差異性。

表1 冷(4 ℃)脅迫處理后冬小麥發(fā)芽率及生長情況

冬小麥‘隴育5號(hào)’(a)、‘隴育5-2’(b)、‘隴育8號(hào)’(c)和‘隴育10號(hào)’(d)

2.2 正常環(huán)境下在冬小麥組織細(xì)胞中的分布規(guī)律

冬小麥‘隴育5號(hào)’(a, b, c)、‘隴育5-2’(d, e, f)、‘隴育8號(hào)’(g, h, i)和‘隴育10號(hào)’(j, k, l)在正常環(huán)境下(25 ℃)培養(yǎng)1 d(a, d, g, j)和2 d(b, e, h, k)時(shí),并采用NBT對冬小麥進(jìn)行染色,藍(lán)色聚合物沉淀代表在植株體內(nèi)的富集程度。在正常環(huán)境下 (25 ℃)DPI處理冬小麥‘隴育5號(hào)’(c)、品系‘隴育5-2’(f)、‘隴育8號(hào)’(i)和‘隴育10號(hào)’(l)2 d

2.2 冷脅迫環(huán)境下,在冬小麥組織細(xì)胞中的分布規(guī)律

對冷(4 ℃)脅迫處理(a, b, c, g, h, i)和冷(4 ℃)脅迫+DPI處理 (d, e, f, j, k, l)后的冬小麥幼苗進(jìn)行NBT染色,‘隴育5號(hào)’(a, d, g, j)、‘隴育5-2’(b, e, h, k)、‘隴育8號(hào)’(c, f, i, l)

3 討 論

冬小麥?zhǔn)歉拭C主要糧食作物,面積和產(chǎn)量均居全省口糧作物之首,其中旱地小麥約占 75%。而隴東作為甘肅冬小麥的主產(chǎn)區(qū),因冬季嚴(yán)寒干旱、春季降水少,春旱和小麥生育后期高溫等環(huán)境因素影響,導(dǎo)致冬小麥的越冬率、產(chǎn)量及品質(zhì)等造成嚴(yán)重影響。因此選育強(qiáng)抗寒抗旱冬小麥品種,是促進(jìn)甘肅冬小麥增產(chǎn)的有效的技術(shù)途徑。目前在甘肅隴東等北部晚熟冬麥區(qū)生產(chǎn)推廣的‘隴育5號(hào)’[19]、‘隴育10號(hào)’[20]和‘隴育8號(hào)’[21]等品種具有較強(qiáng)的抗寒、抗旱性和豐產(chǎn)性,其中‘隴育5號(hào)’成為北部冬麥區(qū)旱地甘肅隴東和寧夏固原的第一大品種,2017年被全國農(nóng)技中心確定為“華北、西北地區(qū)耐旱節(jié)水品種”。本研究通過FISH技術(shù)分析,結(jié)果表明‘隴育5號(hào)’‘隴育8號(hào)’‘隴育10號(hào)’和品系‘隴育5-2’等材料均屬于六倍體材料(2n=42)。在4 ℃冷脅迫環(huán)境下培養(yǎng)7 d后,‘隴育5-2’和‘隴育5號(hào)’的發(fā)芽率和長勢顯著好于‘隴育10號(hào)’‘隴育8號(hào)’,這說明‘隴育5-2’和‘隴育5號(hào)’在冷脅迫環(huán)境下具有較好的適應(yīng)性。

3.2 NADPH酶介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS在冬小麥細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制