涼解感冒合劑質量標準研究*

陳 芳，樊寶娟△，呼延婷婷.2，黃 艷，王夢琪，羅定強

（1. 陜西省食品藥品檢驗研究院，陜西 西安 710065； 2. 國家藥品監督管理局藥品微生物檢測技術重點實驗室，陜西 西安 710065）

涼解感冒合劑由大青葉、牛蒡子、紫荊皮、荊芥等藥材組方，用于治療風熱感冒引起的發熱、惡風、頭痛、鼻塞流涕、咳嗽、咽喉腫痛等癥，具有解表、清熱、宣肺、利咽等功效。方中，馬勃善清肺熱，與桔梗合用有開宣肺氣、清利咽喉、止咳祛痰之效；薄荷疏散風熱，解毒透疹，清利頭目；牛蒡子宣肺發疹，清咽利喉；大青葉清熱解表，涼血解毒；紫荊皮清熱解毒，利濕；荊芥辛溫，開泄腠理，疏散邪氣。全方藥味組成較復雜，涉及辛涼解表、清熱解毒、清利咽喉、宣暢肺氣等，質量標準很難用單一指標體現［1］。為了全面、有效地控制制劑質量，本研究中對方中的桔梗、馬勃藥材進行了薄層色譜（TLC）鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法測定君藥大青葉中腺苷的含量?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Alliance HT 型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；UV-2550 型雙光束紫外可見分光光度計（日本島津公司）；Sartorius BS224S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司，精度為萬分之一）；AE - 240 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為十萬分之一）；KQ - 500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；F2 型恒溫水浴箱（北京化玻聯醫療器械有限公司）。

1.2 試藥

桔梗對照藥材（批號為121028 - 201411），馬勃對照藥材（批號為121417-201302），腺苷對照品（批號為110879 - 200202，純度為99.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；涼解感冒合劑（陜西白鹿制藥股份有限公司，規格為每支10 mL，批號分別為150504，150505，150507，150508，150903，150905，150906，151206，151207，151210）；硅膠G（青島海洋化工廠）；乙腈、甲醇（色譜純，美國天地公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純（西安化學試劑廠）。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

桔梗［2-5］：取樣品10 mL，加7%硫酸乙醇-水溶液（1∶1，V/V）20 mL，加熱回流3 h，放至室溫，用三氯甲烷提取2 次，每次20 mL，合并提取液，用水洗滌2 次，每次30 mL，棄去洗液，提取液用無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液回收溶劑至干，殘渣加1 mL甲醇使溶解，即得供試品溶液。對照藥材按處方工藝進行前處理，加水30 mL，加熱回流30 min，取濾液，同法制備桔梗對照藥材溶液。按處方比例和工藝制備不含桔梗的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法［6］試驗，吸取對照藥材溶液5μL、供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，點于同一硅膠G 薄層板，以三氯甲烷- 乙醚（2∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液顯色，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯色完全一致，特征斑點清晰，分離良好，無拖尾，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

馬勃［7-10］：取樣品10 mL，60 ℃水浴蒸至近干，加二氯甲烷30 mL，加熱回流60 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，即得供試品溶液。取馬勃對照藥材1 g，加水20 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液同法制備，即得對照藥材溶液。取按處方比例和工藝制備不含馬勃的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法［6］試驗，吸取供試品溶液和陰性對照品溶液各20μL、對照藥材溶液5μL，點于同一硅膠G薄層板，以環己烷-丙酮-乙醚（10∶1∶2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，特征斑點清晰，分離良好，無拖尾，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

2.2 HPLC 法測定腺苷含量［11-12］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent-5TC-C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（5∶4∶91，V/V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取腺苷對照品適量，精密稱定，加水制成質量濃度為9.472 0μg/mL的對照品溶液。精密量取樣品10 mL，置具塞錐形瓶中，水浴蒸干，冷卻至室溫，精密加入30%甲醇溶液50 mL，稱定質量，密塞，超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）30 min，冷卻至室溫，再次稱定質量，用30%甲醇溶液補足減失的質量，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。根據處方工藝制備缺大青葉的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2.2項下供試品溶液、對照品溶液和陰性對照品溶液各10μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液相同保留時間處有相應色譜峰出現，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取2.2.2項下對照品溶液2，5，10，15，20，25 μL，按2.2.1 項下色譜方法進樣測定，以對照品溶液進樣量（X，ng）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=3 016.8X-11 350，r=1.000 0（n=6）。結果表明，腺苷進樣量在18.944 0～236.800 0 ng范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密量取2.2.2 項下對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件重復進樣測定6 次，記錄峰面積。結果腺苷峰面積的RSD為0.39%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2.2 項下供試品溶液適量，分別于0，4，8，12，16，20，24 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果腺苷峰面積的RSD為1.26%（n= 7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內穩定性良好。

重復性試驗：精密量取同一批（批號為150505）樣品6 份，各10 mL，按2.2.2 項下方法分別制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算腺苷含量。結果腺苷含量的RSD為2.05%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：分別取樣品（每支含腺苷0.496 0 mg）6 份，各5 mL，分別加入1 mL 腺苷對照品溶液（質量濃度為0.261 6 mg/ mL），低溫蒸干，冷卻至室溫，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果見表1。

2.2.4 樣品含量測定

分別精密量取10 批樣品各10 mL，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，并計算腺苷含量。結果10 批樣品中每支分別含腺苷0.61，0.58，0.57，0.58，0.57，0.54，0.52，0.50，0.50，0.58 mg，平均每支含腺苷0.56 mg。

3 討論

3.1 TLC 鑒別藥材選擇

分別從提取溶劑、提取方法、吸附劑、顯色方法等對大青葉、紫荊皮進行了考察［13-17］，結果大青葉供試品溶液色譜與對照品溶液及對照藥材溶液色譜在相應位置均未顯相同顏色的斑點，或顯相同顏色的斑點、但斑點分離度不好；紫荊皮供試品溶液色譜與對照藥材溶液色譜相應位置均未顯相同顏色的斑點。故大青葉、紫荊皮TLC 鑒別有待進一步研究，暫未被列入涼解感冒合劑的質量標準。最終僅對桔梗和馬勃作TLC鑒別。

3.2 含量測定指標成分選擇

現代藥理學研究表明，大青葉具有抗病毒［18］、抗內毒素［19］、抑菌［20］等作用，常用于上呼吸道感染、流行性乙型腦炎、麻疹肺炎、咽喉炎、扁桃體炎等的治療［21］，主要成分有腺苷、靛玉紅、靛藍和氧化苦參堿［20，22］。腺苷是一種內源性核苷，遍布于人體的細胞中，是重要的核苷類抗病毒藥物，具有多種生物學活性，可用于治療多種病毒性疾病，主要破壞病毒轉錄過程，通過選擇性抑制病毒的聚合酶而阻止病毒復制，進而發揮抗病毒作用［23-24］。有研究報道，靛藍、靛玉紅不具備抗毒素活性［25］，且樣品中大青葉經水提工藝提取，而靛玉紅、靛藍均為脂溶性成分，故選擇腺苷作為含量測定的指標成分。

3.3 樣品提取方法考察

預試驗中，對加熱回流提取法和超聲提取法進行了比較，發現超聲提取所得腺苷含量明顯高于同條件下加熱回流提取所得含量，故選擇超聲提取法。分別考察以水、甲醇和30%甲醇溶液為提取溶液進行超聲提取的效果，發現30%甲醇溶液提取效率最高，故選擇30%甲醇溶液作為提取溶劑；考察了超聲處理20，30，40 min 的提取效果，發現超聲提取20 min 時含量最低，30 min和40 min所得腺苷含量基本一致，考慮到時間成本，故選擇超聲提取30 min；考察了溶液量為25，50，100 mL 30%甲醇溶液的提取效果，發現50 mL和100 mL所得腺苷含量相當。故選擇50 mL 30%甲醇溶液進行提取。

3.4 色譜條件考察

分別考察了Ultimate 和Agilent 2 個品牌的色譜柱，結果分離度均良好，不影響被測成分的含量，故選擇Agilent-5TC-C18（2）柱進行試驗。分別考察了不同柱溫（25，30，35 ℃）對被測成分含量的影響，發現柱溫不影響其含量，故柱溫選擇30 ℃。取質量濃度為9.472 0μg/mL的腺苷對照品溶液，于200～400 nm 波長范圍內進行掃描，結果于260 nm波長處有最大吸收；分別于255，260，265 nm 波長處測定，結果分離度均良好，不影響被測成分的含量，故檢測波長選擇260 nm?？疾炝艘译?水（6∶94，V/V）作流動相對檢測效果的影響，結果供試品溶液色譜圖中的目標峰未達到基線。pH 6.5的磷酸鹽緩沖液［取0.01 mol/L磷酸二氫鈉68.5 mL與0.01 mol/L磷酸氫二鈉31.5 mL，混合（pH 6.5）］- 甲醇（85∶15，V/V）所得色譜圖分離度較好，但流動相配制復雜，且對色譜柱的損害較大。最終選擇流動相為甲醇- 乙腈-水（5∶4∶91，V/V/V）。

3.5 含量限度擬訂

由含量測定可知，樣品中腺苷含量為每支0.50～0.61 mg，平均每支0.56 mg。又對3 批大青葉藥材中腺苷轉移率進行了考察，平均轉移率為53.29%，鑒于該制劑中大青葉藥材為水提工藝，轉移率基本合理。建議采用腺苷含量平均值的70%作為限度。故擬訂涼解感冒合劑中每支含腺苷不少于0.40 mg。

3.6 方法評價

所建立的方法簡便易行、結果準確可靠，可用于涼解感冒合劑的質量控制。