基于灰色關聯度分析的蓽澄茄藥材質量評價

林倩倩

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院，福建 福州 350000）

蓽澄茄來源于樟科植物山雞椒Litsea cubeba（Lour.）Pers. 的干燥成熟果實，性溫、味辛，歸脾、胃、腎、膀胱經，具有溫中散寒、行氣止痛之功［1］。蓽澄茄主要含有揮發油、黃酮類、脂肪酸等成分［2-3］，廣泛分布于我國南部。現行質量標準2020 年版《中國藥典（一部）》中無含量測定控制項，但已有研究報道對蓽澄茄質量的評價主要是從揮發油中多種成分［4-5］或蘆丁單一化合物［6］等方面進行研究。中藥質量評價需符合中醫藥作用的整體觀特點。灰色關聯度分析（GRA）是根據相似度來預測因素間的關聯程度［7-9］，通過分析不同批次藥材的綜合質量受其他因素影響的強弱，以得分為依據評價藥材質量的優劣，已廣泛用于含有復雜成分的中藥質量控制。本研究中通過測定14 批不同產地蓽澄茄藥材中水分、總灰分、浸出物、檸檬醛和蘆丁含量，建立評價蓽澄茄藥材質量的GRA 模型，對不同產地藥材進行綜合評價排序，并采用主成分分析（PCA）法對產生差異的因素進行分析，為蓽澄茄藥材質量的快速評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配有可變波長檢測器（VWD）；MS105DU/A型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為0.01 mg）；SX4-10Z型箱式電阻爐（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；GW202V型電熱鼓風干燥箱（上海雙旭電子有限公司）；JK - DY600 型超聲波清洗儀（合肥金尼克機械制造有限公司，功率為600 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

檸檬醛對照品（批號為190178 - 201701，含量99.5%），蘆丁對照品（批號為100080 - 202012，含量81.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；14 批蓽澄茄藥材分別從藥材市場收集，經福建中醫藥大學董永利教授鑒定為正品，樣品信息見表1；甲醇、乙腈均為色譜純，購自美國Merk公司；其余試劑均為分析純。

表1 蓽澄茄藥材樣品信息Tab.1 Information of Litseae Fructus samples

2 方法與結果

2.1 蓽澄茄藥材中水分、總灰分及浸出物測定

參照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0832 水分測定法第四法（甲苯法），通則2302灰分測定法、浸出物測定法中醇溶性浸出物測定法對14 批藥材進行測定。結果見表2。

表2 蓽澄茄藥材樣品中水分、總灰分、浸出物及檸檬酸、蘆丁含量測定結果（%，n=3）Tab.2 Results of content determination of water，total ash，extracts，citral and rutin in Litseae Fructus（%，n=3）

2.2 蓽澄茄藥材中檸檬醛和蘆丁含量測定

2.2.1 色譜條件［10-12］與系統適用性試驗

色譜柱：Waters XTERRA C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min 時30%A，20～45 min 時30%A →75%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。供試品溶液在與混合對照品溶液相同保留時間處有相應色譜峰出現。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2.2 溶液制備

混合對照品溶液：精密稱取檸檬醛和蘆丁對照品各適量，用甲醇溶解制成質量濃度分別為90.19，189.7 0μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：取蓽澄茄藥材粉碎，過4 號篩，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入85%甲醇溶液50 mL，稱定質量，超聲提取（功率為500 W，頻率為40 kHz）40 min，放冷，用85%甲醇減失的質量，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 方法學考察

精密吸取2.2.2 項下各溶液，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，結果精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩定，方法重復性良好。

2.2.4 樣品含量測定

取供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件測定3 次，記錄峰面積，并計算含量。結果見表2。

2.3 蓽澄茄質量灰色關聯度分析

參考序列選擇：設有n個藥材樣品，每個藥材樣品有m個評價指標，組成一個評價單元序列｛Xik｝（i=1，2，3，…，n；k=1，2，3，…，m；n=14，m=5）。從質量評價的角度，浸出物、檸檬醛含量和蘆丁含量3 個指標越高越好；因水分、總灰分與蓽澄茄質量呈負相關，故選用其倒數作為評價指標，與檸檬醛和蘆丁含量指標共同構成指標矩陣［13-14］。設最優/最差參考序列分別為｛Xsk｝和｛Xtk｝（k=1，2，3，…，m）。設最優/最差參考序列的各項指標為n個藥材樣品對應指標的最大/ 最小值，即｛Xsk｝和｛Xtk｝。

原始數據無量綱化處理：本研究中采用均值化法對各評價指標進行處理，公式為Yik=Xik/Xk，式中Xik表示原始數據，Xk表示第n個蓽澄茄藥材樣品第k個指標的均值，Yik為量綱化處理后的數據。詳見表3。

表3 原始數據無綱量化處理Tab.3 Dimensionless processing results of raw data

計算關聯系數、關聯度及相對關聯度：按表4 中公式（1）和公式（2）分別計算相對于最優/最差參考序列的關聯系數（r），按公式（3）和公式（4）分別計算相對于最優/最差參考序列的關聯度［ri（s）］，按公式（5）計算不同產地蓽澄茄藥材樣品的相對關聯度（ri）。r值越大，表明評價單元序列與參考序列相關度越高。ri較好地詮釋灰色關聯理論，根據ri對評價單元進行排序，可得到評價質量佳劣結果。詳見表5。

表4 灰色關聯度分析法相關計算公式Tab.4 The relevant calculation formula of grey correlation analysis method

表5 評價單元序列相對于最優參考序列的關聯系數、關聯度、相對關聯度及排序Tab.5 The correlation coefficient，correlation degree，relative correlation degree and ranking of the evaluation unit sequence relative to the optimal reference sequence

2.4 PCA 綜合評價不同產地蓽澄茄

采用SPSS 22.0 和SIMCA 16.1 軟件對表2 數據進行PCA［15-16］，提取出特征值大于1 的2 個主成分，分析上述5 個指標（檸檬醛、蘆丁、水分、總灰分、浸出物）分別對2個主成分的貢獻率。主成分分析特征值及方差貢獻率見表6，主成分因子載荷矩陣見表7，碎石圖見圖2。

圖2 主成分分析碎石圖Fig.2 Screen plot of PCA

表6 蓽澄茄藥材樣品有效成分含量主成分分析特征值和方差貢獻率Tab.6 The eigenvalues and variance contribution rate of principal component analysis for the content of active components in Litseae Fructus

表7 主成分因子載荷矩陣Tab.7 Factor load matrix of principal components

根據各指標成分得分系數矩陣，得因子得分表達式F1= 0.559X檸檬醛+ 0.605X蘆丁+ 0.413X水分-0.208X總灰分+ 0.151X浸出物，F2= - 0.117X檸檬醛-0.083X蘆丁- 0.202X水分+ 0.425X總灰分+ 0.499X浸出物；將各成分方差貢獻率作為權重，可得各批次蓽澄茄綜合得分（F）。按公式計算，F=54.374F1+ 20.931F2。不同產地地蓽澄主成分值、綜合得分及排序見表8。

表8 不同產地藥材樣品主成分值、綜合得分及排序Tab.8 Principal component values，comprehensive scores and ranking of Litseae Fructus from different producing areas

3 討論

灰色關聯度模型對數據沒有嚴格要求，可充分利用較少的原始數據尋找體系中的規律性，區分不同指標對整體的影響。本研究中，采用GRA 法評價蓽澄茄藥材質量，排前3位的分別產自福建建陽、云南麗江、貴州貴定，ri分別為0.66，0.53，0.50，可在以上產地區域建立高質量栽培基地，規范加工方法，總體提升蓽澄茄藥材的品質；評價排后3 位的均產自廣西，其中廣西蒼梧ri為0.30。蓽澄茄藥材樣品質量排前3 位的綜合得分分別為131.994，124.605，106.291，排最后2 位的分別為32.704（S1）和46.113（S3），均產自廣西。2 種評價方法結果表明，蓽澄茄藥材樣品質量排名基本一致，以福建產的品質較優，可能與藥材的生長特性、采收環境和地理位置相關，GRA 法準確、科學、直觀，可為篩選蓽澄茄優質種源提供參考依據。

由表6 和圖2 可知，第1 主成分與第3 主成分之間連線較為陡峭，特征值下降明顯，即前3 個主成分對解釋變量的貢獻最大，而第3 主成分特征值小于1，前2 個成分累計貢獻值達75.305%，故提取2個主成分。由表7 可知，檸檬醛、蘆丁、浸出物在第1 主成分上載荷較高，總灰分和水分在第2 主成分有較高載荷。故建議將檸檬醛、蘆丁含量測定納入藥品質量標準中，與浸出物、總灰分和水分等檢查項共同考察蓽澄茄藥材質量。

中藥材是由多種成分通過多靶點、多環節綜合作用于機體而發揮治療作用，但藥材因產地不同質量也有所差異，故有必要選擇多個指標成分綜合評價藥材的質量并進行分區域管理。本研究中采用GRA評價模型進行質量分析，并與PCA 法結果比較，選擇了蓽澄茄的水分、總灰分、浸出物及檸檬醛、蘆丁含量5個指標，能客觀反映不同產地蓽澄茄藥材的內在質量。但由于蓽澄茄結構復雜，研究還不夠深入，從現有的指標難以進行全面評價，且尚未發現特有成分。未來還需從蓽澄茄原植物體內中藥化學代謝途徑出發，全方位研究其有效成分，以實現蓽澄茄質量評價體系從點到面的轉變。