超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定肋柱花藥材中5 種活性成分含量*

蘭 婷，朱賁賁，陳 圓，楊鵬杰，王巍嵩△

（1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050； 2. 北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院內(nèi)蒙古醫(yī)院·內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010040）

肋柱花為龍膽科肋柱花屬植物肋柱花Lomatogonium rotatum（L.）Fries ex Nym.的干燥全草，分布于我國東北、內(nèi)蒙古、陜西、四川、新疆、甘肅、青海等地［1-2］。蒙藥名為哈比日干·地格達，亦稱查干·特木日·地格達、扎格地格·嘎日布［3］。味苦，性寒，效鈍、糙、輕、燥，具有平息協(xié)日、清熱、愈傷、健胃等功效，主治協(xié)日熱、肝膽熱、瘟疫、傷寒、黃疸、消化不良、中暑頭痛、傷熱等癥，是蒙醫(yī)用于治療肝膽疾病的傳統(tǒng)藥物［4］。肋柱花藥材主要含有獐牙菜苦苷、木犀草素、異葒草苷、當(dāng)藥黃素、芒果苷等活性成分，具有清肝利膽、抗菌消炎、解熱鎮(zhèn)痛等藥理活性［5-9］。其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊》，但未測定其中活性成分的含量。目前，多采用高效液相色譜（HPLC）法對肋柱花藥材中少數(shù)活性成分進行定量分析［10-13］，難以反映藥材的整體質(zhì)量。超高效液相色譜- 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC - QQQ - MS/MS）法不僅能提供充足的化合物結(jié)構(gòu)信息，且特有的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式具有較高的選擇性、專屬性和靈敏度，在色譜峰不需要完全達到基線分離的情況下即可實現(xiàn)多種含量差異較大化合物的同時定量分析［14-15］。本研究中采用UPLC - QQQ -MS/ MS 法同時測定肋柱花藥材中木犀草素、異葒草苷、獐牙菜苦苷、芒果苷、當(dāng)藥黃素的含量，并結(jié)合主成分分析（PCA），以高效、準(zhǔn)確、全面地對蒙藥材肋柱花進行質(zhì)量分析和控制，為其進一步開發(fā)利用奠定藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo U3000 型超高效液相色譜儀，Thermo TSQ ULTRA EMR 型三重四極桿質(zhì)譜儀，均購自美國Thermo公司；CPA225D 型分析天平（精度為十萬分之一），BSA423S-CW 型分析天平（精度為萬分之一），均購自德國Sartorius公司；KQ2200DE型臺式超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

木犀草素對照品（C1，批號為111520 - 202107，純度為96.3%），異葒草苷對照品（C2，批號為111974 -201401，純度為94.0 %），獐牙菜苦苷對照品（C3，批號為110785-201404，純度為98.3%），芒果苷對照品（C4，批號為111607- 201704，純度為98.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；當(dāng)藥黃素對照品（C5，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展公司，批號為210710，純度為98.0%）；甲醇（美國Fisher Scientific 公司，色譜純、分析純）；超純水（美國Millipore 公司）；其余試劑均為分析純；肋柱花藥材信息見表1，每個產(chǎn)地分別收集3批，經(jīng)內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蒙醫(yī)醫(yī)院敖德畢力格主任藥師鑒定均為正品。

表1 肋柱花藥材信息Tab.1 Information of Lomatogonii Rotati Herba samples

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：甲醇（A）- 含5 mmol/ L 甲酸銨的0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～2 min 時5%A，2～5 min 時5%A →95%A，5～10 min 時95%A，10～10.1 min 時95%A → 5%A，10.1～12 min 時5%A）；流速：0.25 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

掃描模式：MRM；離子源：電噴霧電離（ESI）；電離模式：ESI-（木犀草素、芒果苷），ESI+（異葒草苷、獐牙菜苦苷、當(dāng)藥黃素）；噴霧電壓：3 500 V（正離子模式）、3 000 V（負(fù)離子模式）；霧化溫度：300 ℃；吹掃氣壓力：40 psi；輔助氣壓力：10 psi；毛細(xì)管溫度：350 ℃。其他質(zhì)譜條件見表2。

表2 肋柱花藥材中5種活性成分的質(zhì)譜條件Tab.2 MS parameters of five active components in Lomatogonii Rotati Herba

2.2 溶液制備

取肋柱花藥材（批號為NK01）適量，粉碎，過4 號篩，取粉末0.2 g（精確至0.000 1 g），加甲醇25 mL（精確至0.01 mL），密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

取干燥至恒定質(zhì)量的木犀草素、異葒草苷、獐牙菜苦苷、芒果苷、當(dāng)藥黃素對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制備成質(zhì)量濃度分別為12.9，12.6，9.1，9.8，11.4 mg/L的單一對照品貯備液，用于優(yōu)化質(zhì)譜條件。其他梯度濃度的對照品溶液由甲醇稀釋單一對照品貯備液獲得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，按2.1項下試驗條件進樣測定，木犀草素、異葒草苷、獐牙菜苦苷、芒果苷、當(dāng)藥黃素均能有效分離，色譜峰峰形對稱，表明方法專屬性強。詳見圖1。

圖1 超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.1 UPLC-QQQ-MS/MS spectrum

線性關(guān)系考察：取2.2項下各單一對照品貯備液適量，用甲醇逐級稀釋成系列混合對照品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、待測化合物質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)進行線性回歸。結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系考察、檢測限與定量限確定、精密度試驗結(jié)果Tab.3 Results of the linear relation test，LOD，LOQ and the precision test

檢測限與定量限確定：取線性關(guān)系考察項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下試驗條件進樣測定，以信噪比（S/N）為3時的質(zhì)量濃度為檢測限，以S/N為10時的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果見表3。

精密度試驗：取線性范圍低、中、高質(zhì)量濃度混合對照品溶液，按2.1項下試驗條件1 d內(nèi)連續(xù)進樣測定6次及連續(xù)測定6 d，根據(jù)回歸方程計算質(zhì)量濃度，并記錄峰面積和保留時間。結(jié)果見表3，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取藥材（批號為NK01）粉末適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，16，24 h 時按2.1 項下試驗條件進樣測定，根據(jù)回歸方程計算質(zhì)量濃度。結(jié)果木犀草素、異葒草苷、獐牙菜苦苷、芒果苷、當(dāng)藥黃素峰面積的RSD分別為1.83%，0.92%，1.15%，1.86%，1.58%（n= 6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取藥材（批號為NK01）粉末0.2 g，精密稱定，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果木犀草素、異葒草苷、獐牙菜苦苷、芒果苷、當(dāng)藥黃素含量的RSD分別為1.62%，2.00%，0.89%，1.96%，1.02%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：分別取6 份已知含量的藥材（批號為NK01）粉末0.1 g，精密稱定，等量精密加入混合對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果均符合AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals對供試品中回收率限度的要求。詳見表4。

表4 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

分別取12 批不同產(chǎn)地藥材樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，帶入回歸方程計算含量。結(jié)果見表5。

表5 肋柱花藥材樣品中5種活性成分含量測定結(jié)果（mg/g）Tab.5 Results of the content determination of five active components in Lomatogonii Rotati Herba（mg/g）

2.5 PCA

以12 批藥材樣品中5 種活性成分的含量為變量，導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進行PCA，前2 個主成分累積方差貢獻率為68%，其中第一主成分（PC1）的方差貢獻率為36.30%，第二主成分（PC2）的方差貢獻率為31.70%。木犀草素、當(dāng)藥黃素均在PC1 方向上呈正相關(guān)，在PC2方向上呈負(fù)相關(guān)；獐牙菜苦苷、芒果苷在PC1和PC2 2 個方向上均呈正相關(guān)；異葒草苷在PC1 和PC2 2 個方向上均呈負(fù)相關(guān)。PC1 的最大貢獻成分為木犀草素（0.623 0）和獐牙菜苦苷（0.520 5），PC2 的最大貢獻成分為芒果苷（0.753 3）。詳見表6和圖2。

圖2 肋柱花藥材樣品中5種活性成分的主成分分析結(jié)果Fig.2 PCA results of five active components in Lomatogonii Rotati Herba

表6 肋柱花藥材樣品中5種活性成分對主成分的貢獻值Tab.6 The contribution values of five active components to the principal components in Lomatogonii Rotati Herba

3 討論

3.1 色譜與質(zhì)譜條件選擇

超聲提取法廣泛應(yīng)用于天然藥物的定量分析，較回流提取法具有方便、快速、消耗溶劑少的優(yōu)點。預(yù)試驗中采用甲醇超聲提取法提取肋柱花，超聲處理30 min、料液比為1∶125（g∶mL）時提取效率最高。

流動相系統(tǒng)考察了甲醇-水和乙腈-水對各活性成分含量的影響，結(jié)果顯示無差異。考慮甲醇價格低、毒性小，故流動相選擇甲醇- 水。在甲醇- 水中添加0.1%甲酸可明顯抑制拖尾現(xiàn)象，改善色譜峰峰形，且具有較高的離子化效率，便于質(zhì)譜定量。加入5 mmol/L甲酸銨后環(huán)烯醚萜類成分獐牙菜苦苷即形成穩(wěn)定的［M-NH4］+準(zhǔn)分子離子峰，故最終確定流動相為甲醇-含5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液。

5 種活性成分的對照品溶液采用外接蠕動泵直接進樣的方法，以子離子響應(yīng)最強時的參數(shù)來優(yōu)化待測離子對的掃描模式、碰撞能量及最優(yōu)質(zhì)譜條件。其中，異葒草苷、獐牙菜苦苷、當(dāng)藥黃素在正離子模式下更穩(wěn)定、響應(yīng)值更高；木犀草素、芒果苷在負(fù)離子模式下易失去1 個質(zhì)子，生成穩(wěn)定的［M-H］-的準(zhǔn)分子離子峰。故采用MRM 模式下正負(fù)離子切換掃描模式同時對5種活性成分進行定量分析。

3.2 樣品含量測定結(jié)果分析

由表5 可知，肋柱花藥材樣品中5 種活性成分的總含量為39.85～67.82 mg/ g，不同產(chǎn)地肋柱花藥材的含量差異明顯，其中以8月收集于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟東烏旗的總含量最高；環(huán)烯醚萜類化合物獐牙菜苦苷含量最多（33.87～61.44mg/g），其次為當(dāng)藥黃素（2.14～5.33mg/g），黃酮類成分芒果苷、木犀草素、異葒草苷在各個產(chǎn)地的藥材樣品中均含量較低，表明活性成分含量與原藥材的產(chǎn)地及生長狀態(tài)相關(guān)。

PCA 結(jié)果顯示，PC1 和PC2 的方差累積貢獻率大于50%，且5 種活性成分在2 個主成分方向上呈不同的相關(guān)性。篩選出的木犀草素、獐牙菜苦苷、芒果苷可作為肋柱花藥材的質(zhì)量控制標(biāo)志物。

3.3 方法評價

本研究中建立的UPLC-QQQ-MS/MS 法操作簡便、專屬性強、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，可同時定量分析肋柱花藥材中環(huán)烯醚萜類、黃酮類、酮類化合物，作為蒙藥材肋柱花質(zhì)量控制、藥理活性、藥代動力學(xué)等相關(guān)研究的參考依據(jù)，且對其進一步開發(fā)利用、推動民族醫(yī)藥事業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展有重要意義。