九蒸九曬和九蒸九烘干燥工藝對何首烏化學成分的影響*

姜譽弘，劉史佳，任 娟，龐會明

（南京中醫藥大學附屬醫院·江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029）

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb. 的干燥塊根［1］，含有蒽醌類、二苯乙烯苷、磷酯類、糖類等化學成分［2］，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便等功效，以及肝毒性、腎毒性等副作用［3］。炮制后，二苯乙烯苷含量下降，結合型蒽醌轉變成游離型蒽醌，毒性減弱［4］，性溫，具有補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨、化濁調脂等功效［5］。加輔料炮制的記載始于唐代，宋代之后“九蒸九曬”為其最常用的炮制方法［6-7］，且為我國有代表性的“四大九蒸貨”之一［8］。何首烏九蒸九曬后，藥物滋膩黏稠的性質減弱，變得更易消化，藥性更純、更平和。但由于炮制周期長，工藝煩瑣，易受到氣候影響而腐爛霉變［9-10］。九蒸九烘法與九蒸九曬法非常接近，不受氣候、溫度、相對濕度等自然條件的影響，且能縮短制藥周期，可有效避免藥材因未及時曬干而發霉變質。本研究中擬用九蒸九烘法代替九蒸九曬法，為九制何首烏大生產提供理論數據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2998 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；SK6200H 型超聲波清洗機（上海科導超聲儀器有限公司，功率為280 W，頻率為50 kHz）；HH-6 型數顯恒溫水浴鍋（國華儀器制造有限公司）；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；AX224ZH/ E 型電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司，精度為萬分之一）；Sartorius BP211D 型電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

何首烏生品（貴州信邦中藥材發展有限公司，批號分別為20200410，20200611，20210114），經江蘇省中醫院劉志輝主任中藥師鑒定為正品；沒食子酸對照品（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號為C11987277，含量大于91.5%）；5 - 羥甲基糠醛對照品（批號為H12M9Z61023，含量大于99.2%），二苯乙烯苷對照品（批號為H08J11E115101，含量大于99.8%），均購自上海源葉生物科技有限公司；大黃素對照品（批號為210620，含量大于96.0%），大黃素甲醚對照品（批號為210713，含量大于99.2%），均購自南京聚康醫藥化工有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 炮制品制備與性狀

九蒸九曬炮制品：取何首烏塊10 kg，用黑豆汁（每100 kg 何首烏塊，用黑豆10 kg）拌勻，置蒸鍋中蒸透無白心，蒸制不少于24 h，置夏季陽光下自然干燥2 d，取500 g，封存，標記；余藥用蒸鍋中原液拌勻，繼續蒸24 h，陽光下自然干燥，取500 g，封存，標記；余藥同上操作，共9次，即得。

九蒸九烘炮制品：取何首烏塊10 kg，用黑豆汁（每100 kg 何首烏塊，用黑豆10 kg）拌勻，置蒸鍋中蒸透無白心，蒸制不少于24 h，置50 ℃烘房干燥10 h，取500 g，封存，標記；余藥用蒸鍋中原液拌勻，繼續蒸24 h，置50 ℃烘房干燥，取500 g，封存，標記；余藥同上操作，共9 次，即得。

樣品性狀：何首烏生品表面紅棕色，體重，質堅硬，斷面淺黃色，顯粉性。在九蒸九制過程中，飲片的顏色逐漸加深，表面顯黑褐色或棕褐色，質硬，斷面角質樣，棕褐色或黑色。第9次炮制后，何首烏有明顯蠟樣光澤，曬干品與烘干品無明顯差異。詳見圖1。

2.2 浸出物測定

參考2020年版《中國藥典（四部）》通則2201 浸出物測定法項下的熱浸法測定醇溶性浸出物，取樣品粉末（過2 號篩）4 g，精密稱定，置250 mL 錐形瓶中，加95%乙醇100 mL，密塞，稱定質量，靜置1 h，連接冷凝管，加熱至沸騰，保持微沸1 h，放冷，取下錐形瓶，密塞，再稱定質量，用95%乙醇補足減失的質量，搖勻，精密量取液體25 mL，置已干燥至恒定質量的蒸發皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，在干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量。3 批何首烏生品與炮制品中醇溶性浸出物測定結果見表1和圖2，在九蒸九曬和九蒸九烘過程中，醇溶性浸出物的含量整體呈下降趨勢；第4 次炮制后，醇溶性浸出物的含量趨于平穩；與生品比較，炮制品中醇溶性浸出物含量降低；曬干品和烘干品中醇溶性浸出物含量無顯著差異。

圖2 何首烏生品與炮制品中醇溶性浸出物測定結果Fig.2 Determination results of alcohol-soluble extract in raw and processed Polygoni Multiflori Radix

2.3 指紋圖譜建立

色譜柱：Hedera ODS- 2 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時10%A～20%A，10～15 min時20%A～30%A，15～30 min 時30%A～45%A，30～35 min 時45%A～80%A，35～40 min時80%A～90%A，40～50 min時90%A～10%A，50～55 min 時10%A）；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10μL。

2.3.2 溶液制備

分別取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黃素和大黃素甲醚對照品各適量，精密稱定，加甲醇配制成質量濃度分別為1 039，2 000，1 177，891，254μg/mL的對照品貯備液。分別吸取上述對照品貯備液1，0.5，2，1，2 mL，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇定容，混勻，即得混合對照品溶液。

取樣品粉末（過4 號篩）1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加90%甲醇25 mL，稱定質量，超聲30 min，放冷，再稱定質量，用90%甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3.3 方法學考察

精密度試驗：取同一份何首烏炮制品適量，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定6次，記錄色譜圖。以二苯乙烯苷的保留時間和峰面積作為參照，結果各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一份何首烏炮制品適量，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，12，24 h 時按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以二苯乙烯苷的保留時間和峰面積作為參照，結果各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一份何首烏炮制品適量，共6份，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定。以二苯乙烯苷的保留時間和峰面積作為參照，結果各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5%（n=6），表明方法重復性良好。

案例針對有機廢水中的①3,4-二氯苯胺、②對氨基苯磺酸、③ 2,4-二硝基苯肼、④ 雙酚A、⑤ 酸性橙、⑥間甲酚紫6種有機污染物，實驗探究了不同溫度下Fenton氧化降解有機物的去除率及反應動力學；在Fenton試劑過量、假定反應初期為一級反應動力學速率常數的基礎上，通過Arrhenius方程計算獲得6種有機物的Fenton反應活化能Ea。

2.3.4 指紋圖譜色譜峰的歸屬與比較

取2.3.2 項下供試品溶液適量，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將結果導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723 版）進行分析，設置第9 次烘干炮制品為參照圖譜，采用平均數法，時間窗寬度為0.1，經過多點校正，生成對照圖譜R，共確定7 個共有峰，詳見圖3 和圖4。與混合對照品溶液色譜圖（圖5）進行比對，共指認5 個成分，即峰3 為沒食子酸，峰5 為二苯乙烯苷，峰14 為大黃素，峰15 為大黃素甲醚，峰a為5-羥甲基糠醛。

圖3 何首烏生品與炮制品高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.3 HPLC overlay fingerprint of raw and processed Polygoni Multiflori Radix

圖4 何首烏生品與炮制品高效液相色譜指紋圖譜共有模式Fig.4 Common pattern of HPLC fingerprint of raw and processed Polygoni Multiflori Radix

圖5 混合對照品溶液高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of mixed reference solution

記錄各色譜峰的峰面積，計算第9 次曬干品與第9 次烘干品各色譜峰的單位質量（g）和峰面積（A）的比值（A9曬品/A生品和A9烘品/A生品），并根據已知對照品的保留時間對炮制品中的色譜峰進行歸屬。結果見表2。何首烏生品與炮制品共檢出22 個色譜峰，包括7 個共有峰和15 個非共有峰。共有峰中，峰1、峰2、峰3（沒食子酸）、峰4、峰14（大黃素）和峰15（大黃素甲醚）在炮制過程中逐漸增加，峰5（二苯乙烯苷）在炮制過程中逐漸降低。非共有峰中，峰7、峰8、峰10、峰11、峰13 第1 次炮制后消失；峰6第2次炮制后消失；峰9和峰12第4次炮制后消失；峰a（5 - 羥甲基糠醛）、峰b 至峰g 為炮制后發現的7個新成分，均在第1次炮制后出現，其中峰a在炮制過程中逐漸增加，峰b、峰f、峰g在炮制過程中逐漸降低，峰c至峰e在炮制過程中呈平穩趨勢。

表2 何首烏第9次曬干和第9次烘干炮制品的色譜峰比較Tab.2 Comparison of chromatographic peaks of processed Polygoni Multiflori Radix by the 9th sun-drying and the 9th oven-drying

2.4 高效液相色譜法測定5 個成分含量

2.4.1 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取2.3.2項下對照品貯備液各適量，置10 mL 容量瓶中，加甲醇制成系列質量濃度的混合對照品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，以待測成分的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。結果見表3。

表3 方法學考察結果Tab.3 Results of the methodological investigation test

精密度試驗：取同一份何首烏炮制品，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定6次，記錄色譜圖。結果沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為3.42%，3.45%，3.82%，2.07%，1.61%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一份何首烏炮制品，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，12，24 h 時按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果沒食子酸、5 - 羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為4.35%，2.50%，2.97%，3.03%，2.42%（n= 6），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

重復性試驗：取同一份何首烏炮制品，精密稱定，平行6 份，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定。結果沒食子酸、5 - 羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚含量的RSD分別為3.50%，4.02%，4.18%，2.95%，2.88%（n= 6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的何首烏炮制品0.3 g，精密稱定，平行6 份，加入2.3.2 項下各對照品貯備液適量，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定。結果沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚加樣回收率的RSD分別為4.20%，2.16%，4.06%，1.28%，0.90%（n= 6），表明方法準確性好。

2.4.2 含量測定

分別取3 批何首烏生品與炮制品，精密稱定，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，計算沒食子酸、5-羥甲基糠醛、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的含量，結果見表4。

表4 3批何首烏生品與炮制品中5個成分含量測定結果（μg/g）Tab.4 Results of content determination of five components in three batches of raw and processed Polygoni Multiflori Radix（μg/g）

3 討論

預試驗中，參考文獻［11-15］，分別對不同流動相系統（乙腈- 水、乙腈- 0.1%磷酸水溶液）進行考察，結果為乙腈- 0.1%磷酸水溶液時的峰形和分離度最優；對不同體積分數甲醇（30%，50%，70%，90%）進行考察，結果以90%甲醇為提取溶劑時提取色譜圖信息較豐富；對樣品加熱回流提取和超聲提取（20，30，40，60 min）進行考察，色譜圖顯示兩者無顯著差異，考慮方法的簡便性與效率性，選擇超聲提取30 min。

本研究中分別從炮制品性狀、浸出物、指紋圖譜、含量測定等多方面分析了何首烏九蒸九曬和九蒸九烘2 種炮制方法的差異。結果表明，九蒸九曬和九蒸九烘炮制品的性狀和浸出物的變化趨勢和程度一致，2 種炮制工藝無顯著差異。系統地分析了何首烏從一蒸一曬（烘）到九蒸九曬（烘）的指紋圖譜結果，揭示了何首烏炮制過程中化學成分的變化規律，為可能出現的藥效變化提供化學基礎。檢出的22 個色譜峰中，歸屬5 個色譜峰，發現7 個新成分；對其中歸屬的5 個成分進行了含量測定，結果第1 批烘品含量比曬品稍高，第2 批和第3 批曬品含量比烘品稍高，考慮到誤差，可認為2 種炮制方法整體結果無顯著差異，為探明何首烏九制的最佳炮制條件提供了理論參考。結合實際生產情況，曬干工藝優點在于簡單易行、加工成本較低；而烘干工藝所用時間遠短于曬干工藝，且炮制過程穩定可控，避免了飲片霉變、腐爛等情況的發生，且此工藝研究方法可為其他九蒸九曬飲片的研究提供參考。

在何首烏的后續研究中，擬對炮制工藝過程及其成品進行質量標準研究，建立完善的質量標準體系，并結合炮制工藝的藥理作用和臨床療效探索何首烏的炮制機制，為何首烏九蒸九烘的工業化大生產提供理論依據。