基因修飾小鼠實驗室生物安全管理體系建設

王芊芊， 劉 沖， 傅 軍， 陳若寧， 劉迪文， 汪 洌，

（浙江大學a.實驗動物中心；b.醫學院，杭州 310058）

0 引言

自2021 年4 月15 日，《中華人民共和國生物安全法》正式施行［1］，預示著生物安全自此由規范約束上升到法律約束的高度。生物安全是指國家有效防范和應對危險生物因子及相關因素威脅，生物技術能夠穩定健康發展，人民生命健康和生態系統相對處于沒有危險和不受威脅的狀態，生物領域具備維護國家安全和持續發展的能力［2］。實驗室生物安全是指以實驗室為科研和工作場所時，實驗室的生物安全條件和狀態不低于容許水平，避免危險生物因子造成實驗室人員暴露，向實驗室外擴散并導致危害的綜合措施［3］。

基因修飾小鼠模型在生物學、基礎醫學、腫瘤學、新藥研發和疾病治療等諸多領域已顯示出其優勢與應用前景［4-8］。基因修飾小鼠實驗室的建設也方興未艾，相比于發展基因修飾技術，實驗室生物安全一直是容易被忽視的問題。近年來，多起生物類科研院所和高校實驗室引發的生物安全事件已嚴重威脅甚至危害到公眾的生命安全，因此建立健全基因修飾實驗室生物安全管理系統迫在眉睫。基因修飾小鼠實驗室從性質上并不屬于單一結構的實驗室，其涵蓋分子生物學、細胞生物學、小鼠胚胎操作和基因修飾小鼠飼養繁育實驗室等功能區塊，屬于綜合性實驗室，在管理上難度更大，所面臨的生物安全風險相較于單一功能實驗室更高。以結合基因修飾小鼠實驗室，在生物安全管理體系建設中的管理組織構架、制度建設、風險評估、監督機制和人員培訓等方面進行了有益探索，以期為同類型實驗室生物安全管理提供一定的借鑒和參考。

1 基因修飾小鼠實驗室風險評估

1.1 基因編輯技術的風險

許多人工重組DNA分子都存在著生物安全危害。例如用于重組和擴增DNA 分子的大腸桿菌可能與其他細菌的基因信息發生交換，而其中的某些細菌對人類是具有致病性的。再如，將全部或部分癌基因DNA片段連接到細菌質粒上，這種重組的DNA分子很可能更易在人類或其他物種中傳播，從而增加患癌或其他疾病的風險［9-11］。此外，在操作重組微生物的工作中，還需要考慮的風險包括插入基因編碼是一種已知的毒素還是相對特征不明的毒素？修飾作用是改變宿主的類別還是病毒的細胞趨向性？修飾作用能否增加病毒的復制能力？插入基因能否改變細胞周期？等［3，12］。由于科學界對基因修飾技術的擔憂促使1975 年NIH對重組DNA 分子研究指南的開發。指南同時指導成立了生物安全委員會（institutional biosafety committee，IBC），對使用重組或人工合成技術的研究進行審核和監督，并對研究人員在設計基因治療的實驗給出總體框架［13-14］。在我國，使用基因編輯技術必須遵照《生物安全法》和《基因工程安全管理辦法》等法律法規，并在實驗開展前通過實驗動物福利倫理審查。

1.2 通過基因工程技術研制基因修飾小鼠的風險

通過基因工程技術研制對特定病原體易感的基因修飾小鼠存在很大的風險。例如，利用hACE2 轉基因小鼠研究新型冠狀病毒（COVID-19）的感染機制、疫苗開發和治療［15-17］。在造模以及后續的研究中稍有不慎都極有可能感染研究人員或進而危害公共安全。不涉及感染性基因修飾小鼠的實驗絕不意味著就不存在生物安全的風險。基因修飾小鼠主要可分為轉基因小鼠和基因敲除／敲入小鼠，分別是通過基因工程的手段將一段外源基因片段導入小鼠生殖細胞、胚胎干細胞或早期胚胎中，使其整合進小鼠基因組中并使其表達某一遺傳性狀和通過同源重組原理敲除／敲入某一個或某一段特定基因片段使其喪失或獲得某些遺傳性狀。基因敲除小鼠一般不表達特殊的生物危害，而轉基因小鼠和基因敲入小鼠因引入外源的基因片段，會表達不同于野生型小鼠的外源基因的蛋白，這些蛋白是否會對人類產生威脅？基因在不同物種間的漂移會破壞野生近緣種的遺傳多樣性，如果基因修飾小鼠逃逸很有可能污染野生型小鼠的基因庫也是很大的風險。此外還有增加人畜共患病的傳播機會，甚至給人類帶來災難性的后果［12，18-19］。

因此，基因編輯技術和基因修飾小鼠研制存在著一定的生物安全風險，需制定詳細地審核和監督機制。故實驗室在應用基因編輯技術之前必須通過學校實驗動物福利倫理審查委員會的審批（該委員會審核范圍包含了生物安全相關內容），獲批后方可開展相應的實驗，且委員會會對全實驗流程進行監督。

1.3 基因修飾小鼠運輸、飼養、繁育及實驗中的生物安全風險

基因修飾小鼠的進口、引種和運輸以及到達動物飼養設施后的隔離檢疫過程中都有可能存在感染未知病原微生物的風險。在基因修飾小鼠的運輸中，要特別注意運輸盒的牢固性，以免基因修飾小鼠逃逸，并制定相應的動物逃逸處理應急預案。基因修飾小鼠飼養及繁育過程中，小鼠本身的活動會產生氣溶膠，飼養人員更換小鼠籠盒時，會吸入大量的氣溶膠。如果基因修飾小鼠被病原微生物污染，則可能感染實驗人員。動物實驗活動中可能會出現特別的生物安全問題，如實驗人員可能會被小鼠抓傷或咬傷［20］，或因實驗中操作不當受到的傷害。因此，基因修飾小鼠實驗室從動物引種、運輸、飼養、繁育和研制直至實驗動物人道終點都必須建立全流程、嚴格的管理制度。

2 基因修飾小鼠實驗室生物安全管理體系的建立

實驗室生物安全管理體系的建立是一個系統性工程，必須符合2008 年頒布的國標《實驗室生物安全通用要求》（GB 19489-2008）。在體系的建立和維護過程中，要隨時根據國家相關法律、法規和標準的變化，以及衛生行政主管部門的要求予以修訂，在此基礎上還可以參考WHO《實驗室生物安全手冊》等資料［21］。單位和實驗室領導對于實驗室安全管理體系建立、機構設置和職能劃分以及資源配置等起著決定性作用。實驗室生物安全最高管理者應確定方針和目標［22-23］。

2.1 建立相對完善的基因修飾小鼠實驗室生物安全管理體系

基因修飾小鼠實驗室是學校大型公共技術服務平臺，由醫學院和實驗動物中心（以下簡稱“中心”）共建。生物安全管理工作分為3 個層級［24-25］。第1 級學校成立有實驗室技術安全管理辦公室，管理全校的實驗室安全，包括實驗室生物安全；第2 級是實驗室所屬的醫學院的實驗室技術安全管理辦公室，由院長為第一責任人；第3 級即為實驗室，由實驗動物中心主任負責。中心主任在充分掌握國家相關法規和標準的要求下，負責制定實驗室制度和管理實驗室所有的實驗活動，并明確實驗室的組織構架和其他部門的關系；負責定期組織人員參加安全培訓并制定監督健康計劃；保障實驗室所有安全設施設備的落實到位和定期檢修；確保所有實驗人員熟悉并掌握實驗流程，了解所有可能存在的生物安全風險。中心主任指定1 名實驗室技術負責人，負責提交實驗計劃和安全評估報告并負責實驗室所有實驗項目的具體實施。另外指定1 名安全負責人，負責監督實驗室的一切實驗活動是否存在安全風險并有權阻止一切不安全的實驗行為（見圖1）。

圖1 基因修飾小鼠實驗室生物安全管理體系構架

2.2 編制基因修飾小鼠實驗室生物安全管理體系文件

按照生物安全管理體系文件的框架依次編寫實驗室生物安全管理手冊（包含組織構架、人員職責、生物安全管理方針和目標、管理責任和個人責任等內容）、實驗室程序文件（含25 個）、標準操作程序（32 份操作規程和規范）以及生物安全記錄表格（共21 項）和應急預案［26-27］（見表1）。實驗室生物安全管理手冊由實驗動物中心主任審核后實施，并根據實驗室實際運行情況定期修訂。

3 基因修飾小鼠實驗室的設計與管理

3.1 實驗室的設計

分子細胞學實驗室主要功能是完成基因修飾小鼠研制的上游和下游實驗，包括載體構建、載體的驗證、ES細胞培養和傳代、打靶ES 細胞的篩選和基因修飾小鼠的基因型鑒定等工作。實驗室屬于生物安全Ⅰ級實驗室，設計符合BSL-1 的建設要求［28］，根據主要實驗內容進行必要的分區：樣本制備區、試劑配置區、清洗滅菌區、試劑存放區和PCR區。

小鼠飼養和胚胎操作實驗室設置在中心的屏障系統內，使用許可證編號：SYXK（浙）2018-0016。屬于動物生物安全Ⅰ級實驗室，符合ABSL-1 的建設要求［28-29］。屏障區域為3 走廊設計，采用3 級空氣過濾系統（初、中、高效空氣過濾器），屏障內空氣可達萬級凈化標準。所有實驗小鼠均為SPF級小鼠，并采用獨立通氣式籠具（individual ventilated cages，IVC）飼養。飼料經Co-60 輻照，飲水采用121 ℃，1 h 高溫高壓的滅菌。屏障內設置監控系統，接入中心監控室，除第一更衣室、第二更衣室和風淋室外，每間實驗室和走廊均為監控全覆蓋。

3.2 實驗室安全防護設備配置

分子細胞學實驗室配有應急噴淋和洗眼設備，小鼠飼養和胚胎操作實驗室的生物安全防護設備主要有生物安全柜和脈動真空壓力蒸汽滅菌器。滅菌器每年由杭州市特種設備檢測研究院檢測并出具質檢報告。每半年由中心獸醫團隊用3MTM壓力蒸汽滅菌生物培養指示劑對實際壓力蒸汽滅菌效果進行生物監測。

個人防護裝備主要有防靜電全身隔離衣、手套、醫用外科口罩、3M口罩、面罩、護目鏡和厚底工作鞋等。實驗室安全員會定期檢查和更換所有的防護設備和個人防護裝備。

3.3 實驗室消毒與衛生管理

實驗室和屏障設施初效過濾器每月更換一次，中效過濾器每3 個月更換一次，高效過濾器每年定期更換一次。每天至少用消毒藥水全面消毒一次分子實驗室工作臺面，清潔實驗室地面，所用的消毒劑根據潛在微生物的類別使用75%乙醇或0.5%次氯酸鈉等［22］。實驗過程中如有活性物質濺出要及時清理并消毒，所有操作參照浙大實驗動物中心編制的“分子細胞生物學實驗室洗滌、污物處理操作規程”（LAC-SOP-009）。

實驗小鼠飼養臺面在操作前后均需用消毒劑擦拭，飼養間每天需用消毒水拖地，定期擦拭墻面和頂面，消毒劑需輪換使用以防長期使用同一種消毒劑導致細菌產生耐藥性。所有操作參照浙大實驗動物中心編制的“屏障系統的日常衛生與消毒的操作規程”（LAC-SOP-011）。新的IVC 籠架運至中心后，在特定房間內進行過氧化氫消毒后推至屏障系統內。所有飼養實驗小鼠的IVC籠架和主管道每3 個月全面清洗消毒。所有操作參照浙大實驗動物中心編制的“實驗小鼠IVC籠架清洗消毒的操作規程”（LAC-SOP-024）。

3.4 實驗室儀器和試劑的安全管理

為加強實驗室儀器設備和試劑管理，實驗室設置專人管理所有的儀器設備，負責試劑耗材的采購和保管。建立實驗室儀器設備臺賬，對24 h 供電的儀器采取雙路供電，且連接報警系統。分子生物學所涉及的試劑復雜多樣、危害性強，很多都具有強腐蝕性、毒性和致畸性［30］。因此實驗室建有試劑目錄和分類表（LAC-TABLE-006），整理了各種實驗試劑的理化特性、使用注意事項和存儲要求等信息。設有專人負責試劑訂購、分類和發放工作。對于像溴化乙啶等毒性強、有致癌性的試劑有專用存儲柜。實驗室所用的危險化學品均為雙人雙鎖保管，并有購買、取用記錄（LAC-TABLE-007，LAC-TABLE-008）。

3.5 實驗小鼠疾病預防控制

實驗小鼠的飼養和繁育要嚴把實驗動物質量關，嚴防人畜共患病。措施主要包括：①中心對實驗動物供應商通過問卷調查和實地考察的方式進行審核和評價，不定期對供應商的產品進行抽樣檢查。②對引入中心的實驗小鼠有嚴格的質量審核、隔離檢疫和生物凈化等流程。參照浙大實驗動物中心編制的“實驗動物進出動物設施操作規程”（LAC-SOP-015）、“基因修飾小鼠隔離檢疫操作規程”（LAC-SOP-016）和“基因修飾小鼠生物凈化操作規程”（LAC-SOP-017）。③對屏障內日常飼養的實驗小鼠定期進行微生物質量監測，參照國標“實驗動物微生物學等級及監測”（GB14922.2-2011）。

4 實驗人員管理與培訓

4.1 實驗人員資質管理

實驗室實驗人員管理依托于浙江大學實驗動物中心。人員招聘嚴格按照浙江大學事業性質崗位聘用人才（勞務）派遣員工操作程序。所有實驗人員均具有分子生物學、細胞生物學、醫學、實驗動物學、動物醫學和微生物學等相關學科的專業背景，入職后經專業技術培訓后方可上崗。在ABSL-1 的工作人員均通過浙江省實驗動物技術人員培訓并獲得合格證。操作脈動真空壓力蒸汽滅菌器的工作人員需取得《中華人民共和國特種設備作業人員證》，持證上崗。實驗室1 名技術人員已參加由杭州市衛生健康委員會組織的2021 年杭州市病原微生物實驗室生物安全培訓班并已通過考試，成績合格。

4.2 實驗人員進出管理

分子細胞生物學實驗室工作人員經培訓授權持有門禁卡，憑本人門禁卡進出實驗室。屏障區域采取封閉式管理，出入口處及屏障內每個房間均設有門禁系統，實驗技術人員培訓獲得中心指紋權限和門禁密碼，憑本人指紋和門禁密碼進出屏障系統內的實驗室。實驗人員進出屏障系統必須嚴格按照浙大實驗動物中心編制的“實驗人員進出屏障設施操作規程”（LAC-SOP-018）進行個人防護裝備的穿戴與更換。

4.3 實驗人員健康管理

實驗室新進人員入職前需完成入職健康體檢，對于有相應疾病或對動物毛發過敏等不適宜從事實驗動物飼養管理和操作的人員，中心人事部門將及時調整其工作崗位。實驗室所有工作人員每年至少進行一次體檢，并建立員工健康檔案。

4.4 實驗人員培訓管理

絕大多數實驗室生物安全事故發生的根本原因在于缺乏生物安全意識和疏于管理。有調查表明，很多受訪大學生不了解病原微生物分類、生物安全實驗室等級的分類、動物抓傷和咬傷后處理、生物安全柜的正常使用方法和生物安全防范等［31-32］。因此對從業人員的培訓和教育至關重要。中心定期和不定期組織各項生物安全培訓講座，包括每年組織人員參與學校和學院舉辦的消防安全知識講座和演習。通過組織實驗人員參與各種培訓和講座不斷強化人員的安全意識，降低生物安全風險。

5 生化固廢／液和動物尸體的處理

高校中常見的生化固廢／液有放射性物質、化學試劑和實驗器械和耗材等［33］，基因修飾小鼠實驗室涉及化學試劑種類較多，有些具有很大毒性，或具有致癌致突變性，比如溴化乙啶（EB）染料，不能直接排放。實驗器械和耗材主要有注射器及針頭、口罩、手套、敷料、培養皿、離心管、移液管和培養基等，可能會沾染有毒有害物質，決不能與生活垃圾混放。基因修飾小鼠實驗室還涉及實驗小鼠的尸體和組織材料處理。

目前中心管理模式是所有的生化固廢／液全部放入指定的生化固廢／液廢棄物桶，用特定的生化固廢垃圾袋盛裝，當廢棄物達到容器的3／4 時，即由相關人員封口。所有在實驗中產生的碎玻璃、針頭和刀片等銳器一律投入利器盒。學校的生化固廢／液現已實行網絡化管理模式，各實驗室的生化固廢／液和銳器盒由指定人員封扎并收集，在校網園實驗室與設備管理處平臺上提交申請，審核通過后在指定時間將生化固廢／液送到校指定回收點。

實驗小鼠的尸體和組織材料使用專用的生物安全袋密封包裝，稱重登記后送學校指定的動物尸體存放間，放入-20 ℃冰柜內，由具備專業資質的相關公司統一定期清運至校外進行無公害化處理。所有操作參照浙大實驗動物中心編制的“實驗動物人道終點、安樂死與尸體處理操作規程”（LAC-SOP-031）。

6 結語

高校實驗室生物安全因隱蔽性強、人員密集和潛在有毒有害試劑較多等因素往往很容易被忽視，而一旦發生事故又會引起極大的危害。所以建立完善的生物安全防范體系，提前做好生物安全風險評估，制定嚴格的生物安全管理制度和監管機制對于高校實驗室工作的開展至關重要。

基因修飾小鼠實驗室始建于2015 年底，隨著近7年的發展在專業技術上已取得重大突破，建成了穩定的專業技術隊伍，已為本校多個科研團隊提供了基因修飾小鼠研制技術服務，相關成果已發表在《自然》等國際頂級學術期刊。在浙江省實驗動物管理辦公室、校實驗室與設備管理處、醫學院、實驗室技術安全管理辦公室和院領導的多方指導下，基因修飾小鼠實驗室生物安全體系已初步建成，在實驗試劑管理、實驗動物疾病預防控制和實驗人員管理與培訓等方面也已初見成效。通過該體系的建立和運行，有效保障了實驗室的安全運轉，為學校基因修飾技術服務需求保駕護航。但同時，在生物安全制度的落實和監管、實驗人員安全意識、危化品管理上仍需不斷完善。生物安全關系到每一個人的生命健康和家庭幸福，在建設“雙一流”大學的征程上，不僅要全面提升專業技術服務水平為科研支撐做出貢獻，更要以人為本，重視生物安全，加強管理，防患未然，為助力醫藥和生命科學等各學科發展做好有力支撐。

致謝：

感謝浙江大學動物科學學院曾衛東教授對本論文的修改。